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中国化学会第十三届全国分析化学年会

作者：王锐 Jaebum Choo 于法标海南医学院 Hanyang University

细菌病原体如鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌和炭疽芽孢杆菌被列为潜在的生物恐怖试剂的最高级别。目前,比色型侧流试纸条（LFAs）已应用于以上病原菌的检测,但这些常规试纸条在灵敏度和定量分析方面存在不足。因此,迫切需要新的检... 详细信息

细菌病原体如鼠疫耶尔森氏菌、土拉热弗朗西斯菌和炭疽芽孢杆菌被列为潜在的生物恐怖试剂的最高级别。目前,比色型侧流试纸条（LFAs）已应用于以上病原菌的检测,但这些常规试纸条在灵敏度和定量分析方面存在不足。因此,迫切需要新的检测技术来检测这些病原体,特别是在早期污染阶段。基于此,开发了一种新的基于表面增强拉曼散射（SERS）的LFAs用于细菌病原体高灵敏检测。目标特异性的SERS纳米标签（拉曼报告标记的金纳米粒子）被用作替代传统LFAs中的金纳米粒子。使用这些SERS纳米标签,细菌的存在可以通过测试线中的简单颜色变化来识别。此外,通过检测在测试线中捕获的SERS纳米标签的特征拉曼峰强度实现高灵敏和准确的定量分析。比较短的测定时间（15分钟）和微小体积的病原体样品（40μL）即可实现病原体的高灵敏检测。我们相信,所提出的基于SERS的LFA技术由于其优异的分析灵敏度,在早期检测特定的细菌病原体方面具有巨大的潜力。

关键词：表面增强拉曼侧流试纸条高致病性病原菌

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基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸的构建和应用

基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸的构建和应用

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作者：金鑫江南大学

学位级别：硕士

抗生素残留所引起的食品安全问题已经引起全世界的重视,各国针对食品中抗生素都设有最高残留限量。妥布霉素被广泛地用于治疗革兰氏阴性菌等微生物导致的感染,而在畜牧养殖和动物医疗中不加控制的使用导致其在动物源性食品中极易存在残... 详细信息

抗生素残留所引起的食品安全问题已经引起全世界的重视,各国针对食品中抗生素都设有最高残留限量。妥布霉素被广泛地用于治疗革兰氏阴性菌等微生物导致的感染,而在畜牧养殖和动物医疗中不加控制的使用导致其在动物源性食品中极易存在残留,对人类健康乃至生态环境都有巨大的潜在威胁。目前,传统的抗生素检测方法大多受限于仪器设备要求高、需要专业操作、分析时间长等不适合现场点应用,开发快捷、高效、灵敏的抗生素检测方法是具有迫切的需求。论文利用适配体和新型的纳米材料构建了一种双功能侧流层析试纸条,用于妥布霉素快速灵敏的检测。核壳式结构的铂修饰金纳米粒子(Au@Pt NPs)几乎保留了纳米金(AuNPs)的所有特性,同时具有Pt壳层超高的类过氧化物酶催化活性,在底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和HO存在下可迅速生成蓝色产物(即氧化型oxTMB)。催化反应所产生的蓝色信号比AuNPs固有的红色强度更加突出。在构建过程中,妥布霉素特异性适配体(Apt)与其互补探针(cDNA)的杂交双链体通过cDNA 5’末端的巯基化修饰固定在Au@Pt NPs的表面,形成Au@Pt NPs-cDNA-Apt复合物。当待测样品中存在妥布霉素时,Apt优先结合妥布霉素并与cDNA去杂交,Au@Pt NPs-cDNA随液体迁移,游离的cDNA进一步被检测线(T线)和控制线(C线)的固定探针DNA1和DNA2所捕获,使Au@Pt NPs在T线和C线上积聚。其中,DNA1和DNA2分别是cDNA的部分互补探针和完全互补探针。该试纸条提供两种不同的检测方案:一种仅由AuNPs的本征颜色所产生的红色(“低灵敏”模式),另一种由Au@Pt NPs催化底物所产生的更敏感的深蓝色(“高灵敏”模式)。首先,采用种子介导生长3步合成法制备Au@Pt NPs,并对其双功能性质进行研究。然后,检测试纸条的构建和组装,检测原理的探针设计验证通过后,进一步对影响试纸条检测的关键条件进行优化。最后,对试纸条的检测性能及模拟实际样品检测进行考察。主要研究结果如下:(1)制备得到核壳式结构的Au@Pt NPs,分散性良好,粒径均匀,大小在40±2 nm,具有很好的保留初始AuNPs的等离子体光学特性,同时具有很强的酶催化特性;(2)实验得到试纸最佳的检测条件:T线探针DNA1的浓度为5μmol·L、C线探针DNA2的浓度为7.5μmol·L、金标固定量为35μL、NC膜类型为Vivid 170、流动缓冲液为1%BSA+15×SSC、反应时间为5 min;(3)试纸体通过灵敏考察,两种模式下肉眼检出限分别为60 nmol L和5 nmol L,使用胶体金扫描仪或Image J软件进行定量分析,计算两种模式的检测限(LOD)分别为0.09 nmol L和0.02 nmol L;(4)所研制试纸条具有良好的检测特异性和贮存稳定性,并成功地应用于对不同的人工模拟样品中妥布霉素的检测,且检测限均低于欧盟规定的最大残留限量。本论文的研究为妥布霉素残留的现场点检测提供了一种高灵敏度、快速且经济的试纸条解决方案,该试纸条可以在两种模式下运行,实现检测性能的“按需”调整,具有更好的普适性和更广阔的应用前景。

关键词：侧流试纸条妥布霉素适配体纳米粒子现场检测

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上转换材料为信号物资的侧流荧光免疫试纸及方法的研究

上转换材料为信号物资的侧流荧光免疫试纸及方法的研究

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作者：邬能英陕西师范大学

学位级别：硕士

即时检测（Point of Care Testing,简称POCT）是指在患者护理的时间和地点进行的医学检测,是体外诊断领域发展最快的领域之一。即时检测具有成本低、使用方便、节省时间、快速简便等优点,为疾病诊断提供了一种良好的手段,对提高医疗服... 详细信息

即时检测（Point of Care Testing,简称POCT）是指在患者护理的时间和地点进行的医学检测,是体外诊断领域发展最快的领域之一。即时检测具有成本低、使用方便、节省时间、快速简便等优点,为疾病诊断提供了一种良好的手段,对提高医疗服务质量,适应资源匮乏的医疗地区具有极其重要的作用。上转换纳米颗粒（UNCPs,NaYF4:Yb/Er）是掺杂了镧系元素的纳米材料,可以被较长波长的光激发而发出较短波长的光,也指的是受到低能量的光子激发,发射出高能量的光子,其违反了斯托克斯发光（Stokes）,即反-斯托克斯发光（Anti-Stokes）。由于这种独特的光学特性使其具有光学稳定性高、反斯托克斯位移大、对复杂生物样品的检测灵敏、发射波段多和窄等优点,因此,上转换纳米颗粒已被用作新一代免疫分析的荧光标记物。近年来,基于上转换纳米颗粒的侧流免疫分析试纸条的研究受到了更加广泛的关注。因此,本论文设计并建立了两种新型侧流免疫试纸条,用于快速高灵敏的测定氧化应激标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）及热休克蛋白70（Hsp70）。在本研究工作中,通过将上转换纳米颗粒作为荧光标记物与竞争性及夹心免疫分析方法相结合,以8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）及热休克蛋白70（Hsp70）为模型口标分析物,分别成功设计并制备了测定这两种氧化应激标志物的新型免疫侧流试纸条,建立了快速灵敏的测定新方法,并初步应用于人尿液及人血清实际样品中的分析。该研究工作为测定8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）和热休克蛋白 70（Hsp70）提供了新器件和新方法,将促进POCT方法研究的发展,具有重要的科学意义和应用价值。本研究是在国家自然科学基金项口“以手机血糖仪为检测平台的智能传感器的研制及其在DNA过氧化损伤的量化评估中的应用”（21729501,2018年1月-2021年12月）资助下完成。本学位论文由引言、研究报告以及总结与展望三部分组成。第一部分为引言,主要介绍即时检测法、即时检测方法的原理及分类、稀土上转换发光纳米材料的发光机理及侧流荧光免疫试纸法的研究进展,最后提出了本论文的研究背景、研究思路及研究意义;第二部分为研究报告部分,第三部分为总结与展望。研究报告部分由以下两个部分组成。一、测定8-羟基脱氧鸟苷侧流免疫试纸即时检测新方法的研究侧流免疫试纸条作为即时检测的重要工具,受到广泛关注。然而,对于小分子生物标志物的研究却很少。本工作设计建立了一种新型免疫侧流试纸条,用于快速、高灵敏的测定8-羟基脱氧鸟苷,并将其作为小分子生物标志物的模型靶点,通过将上转换纳米颗粒作为荧光信号材料与竞争性免疫分析相结合。以8-羟基脱氧鸟苷抗体（Ab,ab48508）为分子识别物质,以8-羟基脱氧鸟苷抗体标记的上转换纳米颗粒（UCNP-Ab）为信号探针,以牛血清白蛋白（BSA）为8-OHdG的载体蛋白,采用共价法合成8-OHdG-BSA结合物。以8-OHdG-BSA作为捕获探针固定在检测线上,以免疫球蛋白G（IgG）作为捕获探针固定在控制线上。当样品和信号探针滴加到样品垫上时,分析物8-OHdG与信号探针结合形成8-OHdG·UCNP-Ab生物偶联物。所形成的生物偶联物和过量的信号探针均沿试纸条流动,过量的信号探针被固定在检测线上的捕获探针收集,而8-OHdG·UCNP-Ab生物偶联物也被固定在控制线上IgG收集。检测线上的荧光强度与样品中8-OHdG的浓度成反比。基于此,建立了测定8-OHdG侧流免疫试纸及时检测新方法。该方法的检测线性范围为0.1-10 nM,检出限为0.05 nM,6 nM 8-羟基脱氧鸟苷的相对标准偏差为4.4%（n=9）。研究结果表明利用载体蛋白进行小分子生物标志物的竞争性免疫分析是设计即时检测侧流免疫试纸条的一种有前景的方法。二、测定热休克蛋白70侧流免疫试纸即时检测新方法的研究热休克蛋白70（Hsp70）为大分子生物标志物。本工作以热休克蛋白70为检测物质,以热休克蛋白70抗体（Ab1,orb79478）为分子识别物质,以UCNP标记的热休克蛋白70抗体（Ab1,orb79478）为信号探针（UCNP-Ab1）。将热休克蛋白70抗体（Ab2,orb24921）作为捕获探针固定在检测线上,以免疫球蛋白G（IgG）作为捕获探针固定在控制线上。当样品和信号探针滴加到样品垫上后,分析物Hsp70与信号探针结合形成Hsp70·UCNP-Ab1生物偶联物,所形成的生物偶联物和过量的信号探针均沿试纸条流动,生物偶联物Hsp70· UCNP-Ab1被固定在检测线上的捕获探针收集,而过量的信号探针也被固定在控制线上IgG收集,检测线上的荧光强度与样品中的Hsp70浓度成正比,基此,建立了测定Hsp70的侧流免疫试纸即时检测新方法,该方法的线性范围0-12 ng/m

关键词：免疫分析法即时检测侧流试纸条上转换纳米颗粒 8-羟基脱氧鸟苷热休克蛋白70

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基于重组酶聚合酶扩增的曼氏血吸虫核酸可视化检测技术的建立及初步评价

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2022年第3期40卷 337-343页

作者：王丽萍吕超秦志强许静邓王平中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织热带病合作中心国家级热带病国际研究中心上海200025

目的结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD),建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法,并初步评价其检测效能。方法以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列,利用Primer Primer 5软件结合手工... 详细信息

目的结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD),建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法,并初步评价其检测效能。方法以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列,利用Primer Primer 5软件结合手工辅助,设计特异性引物和探针并进行筛选,建立曼氏血吸虫核酸LFD-RPA检测方法。制备不同浓度(1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl)的曼氏血吸虫成虫基因组DNA和含有不同拷贝数浓度(10^(5)、10^(4)、10^(3)、10^(2)、10^(1)、10^(0)、10^(-1)拷贝/μl)的SmCox1重组质粒DNA,评价所建立方法的敏感度。以曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、感染曼氏血吸虫双脐螺(阳性双脐螺)和阴性双脐螺、感染日本血吸虫钉螺(阳性钉螺)和阴性钉螺、华支睾吸虫成虫、大片形吸虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA为模板,评价所建立方法的特异性。将30只雌性BALB/c小鼠随机分为40尾感染组、80尾感染组和健康对照组,每组10只,建立感染小鼠模型,提取感染后1~8周的小鼠粪样和血样DNA,评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能。结果以SmCox1基因片段为靶标建立的曼氏血吸虫LFD-RPA检测方法以39℃、20 min为最佳反应温度和时间。敏感度检测结果显示,SmCox1-LFD-RPA方法对曼氏血吸虫成虫基因组、SmCox1重组质粒的检出限分别为10 fg/μl和10拷贝/μl。特异性检测结果显示,SmCox1-LFD-RPA方法仅对曼氏血吸虫和阳性双脐螺DNA特异,与其他吸虫DNA无交叉反应。SmCox1-LFD-RPA方法对感染小鼠1~8周血样及粪样DNA的检测结果显示,40尾组小鼠自感染后3周开始出现阳性条带,80尾组小鼠自感染后1周开始出现阳性条带,且条带颜色随感染时间延长逐渐加深。结论建立了曼氏血吸虫LFD-RPA检测方法,其检出限低、特异性强,操作简单快捷。

关键词：曼氏血吸虫重组酶聚合酶等温扩增可视化侧流试纸条

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基于等温扩增和侧向流动技术快速检测液体环境中食源性致病菌的研究

基于等温扩增和侧向流动技术快速检测液体环境中食源性致病菌的研...

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作者：付强齐鲁工业大学

学位级别：硕士

液体环境中食源性生物污染物的简单、快速、超灵敏检测对污染物的控制尤为重要。目前,应用在食源性致病菌上的检测方法主要包括传统的生物培养法、抗原抗体法和核酸检测法。这些方法虽然具有一定的精准度和特异性,但是它们费时费力并且... 详细信息

液体环境中食源性生物污染物的简单、快速、超灵敏检测对污染物的控制尤为重要。目前,应用在食源性致病菌上的检测方法主要包括传统的生物培养法、抗原抗体法和核酸检测法。这些方法虽然具有一定的精准度和特异性,但是它们费时费力并且需要专业的操作人员,这严重阻碍了他们在即时检测(point-of-care testing,POCT)中的应用。因此,开发一种高效迅速,简单便携的检测方法显得尤为重要。本课题开发了一个可以快速检测液体环境中食源性致病菌的生物传感器,并且在此基础上进行了深度优化。该传感器基于侧向流动技术结合重组酶聚合酶等温扩增法,可以应用于食源性生物污染物的现场即时检测。本课题主要分为三个体系,主要研究工作如下:(1)肠炎沙门氏菌是一种广泛存在和具有高度传染性的生物污染物,可引起人畜共患疾病。血清型肠炎沙门氏菌的大多数检测方法都是定性的,而定量方法费时、费力,并依赖于大型分析仪器。因此,开发一种快速、简单、定量的检测方法对于在疾病爆发早期阶段的预防和控制感染非常重要。为了满足这一要求,我们开发了一种基于链酶亲和素包裹金纳米粒子(Strept Av-Au NPs)的侧流(LF)试纸条生物传感器,结合重组酶聚合酶等温扩增(RPA),用于快速定量检测血清型肠炎沙门氏菌(***)。Strept Av-Au NPs的合成很简单,并与末端修饰有生物素的DNA牢固结合。此外,RPA可以大大减少检测时间。智能手机被用来收集LF试纸条的图像,并将其输入笔记本电脑进行定量分析。整个过程在不到40 min内完成,不需要大型实验室设备或分析仪器。对于合成的***的DNA序列和培养的纯菌样品,视觉检测限(LOD)分别为1×10-11 M和2.5×103 CFU/m L,定量LOD分别为5.5×10-13 M和91.4 CFU/m L。在重现性测定中,对三种不同浓度的样品,相对标准偏差分别为5.88%、5.13%和4.45%。该生物传感器具有成本低、精度高、定量快等优点,并且被成功应用在了饮用水的实际样品检测中。(2)肠出血性大肠杆菌(EHEC O157:H7)是引起人类腹泻最常见的生物污染物之一,尤其是儿童。EHEC O157:H7可以通过被污染的水或食物,或通过与动物或人的接触传播。目前,免疫学领域用于检测EHEC O157:H7的主要方法是抗原抗体检测和基于聚合酶链反应的核酸检测,这些方法需要昂贵的成本和实验室仪器,不适合医疗卫生条件差的发展中国家在大规模筛选致病菌时使用。为了解决这个问题,本研究开发了一种基于自加热重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的一体化侧流试纸条生物传感器。该生物传感器由试纸条装置、连接器、RPA反应室、支撑装置和加热装置组成,其生产成本远低于抗原-抗体法。整个检测过程在不到25 min内完成,且不需要依赖任何大型实验室设备或分析仪器。对培养的EHEC O157:H7纯菌样品和饮用水中的EHEC O157:H7分别达到了1×103 CFU/m L,3.5×103CFU/ml的视觉检测限(LOD)和104.02 CFU/m L,366.70 CFU/m L的定量LOD。在重现性测定中,对三种不同浓度的样品,相对标准偏差分别为5.39%、3.85%和4.82%。该方法不仅可以快速定量检测样品中的EHEC O157:H7,而且生产成本低,操作简单,便于携带,在医疗设施落后的发展中国家具有良好的发展潜力。(3)免疫学方法是检测环境中生物污染物的有效手段,如抗原抗体法,酶联免疫吸附试验。它们虽然具有很高的特异性和灵敏度,但是它们的检测限(LOD)相对较大。聚合酶链式反应(PCR)及其衍生方法(RT-PCR和多重PCR)的LOD表现良好,但是它们需要专业的操作人员和昂贵的实验设备。为了解决这一问题,本研究开发了一个便携式双重信号放大的侧流试纸条生物传感器用于超灵敏检测液体环境中的生物类污染物。第一种放大是重组酶聚合酶等温扩增(RPA)反应,可以在短时间内对目标物达到指数式放大;第二重放大为链酶亲和素-生物素系统。该方法对肠炎沙门氏菌分别达到了2.5×102 CFU/m L和33.99 CFU/m L的视觉LOD和定量LOD。该方法的LOD要远低于抗原抗体法,同时比前两个体系所报道的侧流试纸条的视觉LOD提高了一个数量级。本研究所开发的侧流试纸条生物传感器成功应用在了饮用水中肠炎沙门氏菌和大肠杆菌实际样品的检测,并对该生物传感器的便携性和检测限进行了不断的优化,使其更好的应用在生物污染物的现场检测。同时,该生物传感器不仅仅只局限在检测食源性生物污染物,也适用于各种含有DNA的污染物的检测。

关键词：食源性致病菌生物传感器重组酶聚合酶等温扩增侧流试纸条即时检测

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