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微生物学报 2023年第9期63卷 3520-3533页

作者：吕丹阳高耀杰赵宇春周洁邓子新蒋明上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一... 详细信息

【目的】通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一锅酶法进行体外反应,并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测反应产物;利用该体系探究Ⅱ型硫酯酶AlpS在合成通路中的功能及作用底物;利用单一变量法对体系温度、pH、最小聚酮合酶(minimal polyketide synthase,minimal PKS)浓度和Ⅱ型硫酯酶AlpS浓度等条件进行优化。【结果】体系所需的聚酮合酶和辅助蛋白均获得可溶性表达;利用一锅酶法成功合成了醌那霉素的早期重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin;加入AlpS蛋白后以上5种产物产量均有不同程度的提高,其中prejadomycin和dehydrorabelomycin提高较为显著;优化后的反应最适条件为:温度30℃、pH 7.0、最小聚酮合酶(AlpA、AlpB和RavC)浓度各2.8μmol/L、AlpS 7.2μmol/L;prejadomycin的产量提高到302 mg/L。【结论】本研究成功利用一锅酶法在无细胞条件下重构了醌那霉素的早期生物合成途径,合成了醌那霉素的重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin。研究进一步验证了硫酯酶AlpS的链释放功能并推测其作用底物。

关键词：醌那霉素一锅酶法体外重构 Ⅱ型聚酮化合物

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四株放线菌中次级代谢产物的基因组挖掘

四株放线菌中次级代谢产物的基因组挖掘

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作者：史海霞山东大学

学位级别：硕士

微生物天然产物是小分子药物的重要来源。尽管基因组研究表明微生物的次级代谢潜力巨大,但是大量未知基因簇在常规培养条件下处于“沉默”或低表达状态。因此,如何高效激活这些“沉默”基因簇是天然产物研究的热点方向之一。前期,本课... 详细信息

微生物天然产物是小分子药物的重要来源。尽管基因组研究表明微生物的次级代谢潜力巨大,但是大量未知基因簇在常规培养条件下处于“沉默”或低表达状态。因此,如何高效激活这些“沉默”基因簇是天然产物研究的热点方向之一。前期,本课题组分离获得了一系列含有AHBA(3-氨基-5羟基苯甲酸)合酶基因的放线菌资源,本论文围绕其中四株放线菌开展了基因组挖掘工作。前期,课题组已从链霉菌LZ35中鉴定了 16种类型共80多个化合物,但仍有20余个基因簇的产物未知。其中,基因簇sm42预测合成含有肉桂酰基的非核糖体肽类化合物(cinnamoyl-containing nonribosomal peptides,CCNPs)。我们通过对LZ35主产物敲除突变株SR111的培养基筛选、扩大发酵和产物追踪分离获得了 CCNP类化合物coprisamide A(1)和1个新开环衍生物(2),明确了coprisamides的生物合成基因簇并提出了可能的合成途径。此外,对SR111进行产孢条件摸索时意外激活了基因簇sm2,分离鉴定了 2个新germicidin糖苷类衍生物 germicidin A-4-O-β-D-glucuronide(3)和 germicidin D-4-O-β-D-glucuronide(4)。上述4个化合物均无明显的抗菌和细胞毒活性。基因组序列分析表明链霉菌XZYN4含有一个编码非安莎新骨架的基因簇,我们采用体外重构与异源表达策略进行了该基因簇的产物挖掘工作。通过启动子筛选、Gibson拼接、BioBrick组装和位点特异性重组等策略的联合使用实现了该基因簇的体外重构,并在白色链霉菌J1074、变铅青链霉菌SBT5、链霉菌SR111和链霉菌S001中进行了异源表达。但是,与野生型相比,异源表达突变株均未检测到明显的差异产物。海洋疣孢菌NS0172预测含有一个合成新5酮安莎霉素的基因簇vas,前期从单调控基因过表达突变株中获得了多个生物合成中间体。为了获得完整的5酮安莎,我们构建了双调控基因过表达突变株,其代谢谱与野生型相比出现了多个差异峰,但产量较低。随后,我们通过饲喂AHBA前体(250 mg/L)将差异产物的产量提高了近8倍。但是,由于扩大发酵时产量不稳定,尚未获得足量差异产物进行结构鉴定。链霉菌S001中含有一个预测可能编码新Ⅱ型PKS的基因簇sm3,通过比较PKS敲除突变株与野生型的代谢谱,我们发现保留时间在12.5 min左右的两个峰消失(编号为A7和A8),提示这两个化合物可能由sm3负责合成。通过扩大发酵、追踪分离和结构解析,我们确定了化合物A7和A8为PKS产物自发环化而成的SEK4和SEK4b。随后,我们尝试通过组成型表达调控基因以期激活sm3的环化酶及后修饰酶基因。与野生型相比,单调控基因过表达突变株有多个差异峰产生,有待进一步分离鉴定。此外,生物活性测定结果表明化合物SEK4对人宫颈癌细胞HeLa具有微弱细胞毒活性(IC50～14.4±0.25 μM)。综上所述,本论文通过对四株AHBA合酶阳性菌的基因组发掘,明确了CCNPs类化合物coprisamide的生物合成基因簇,获得了新germicidin糖苷衍生物,重构并异源表达了 XZYN4中的非安沙基因簇,激活了 NS0172中的新5酮安莎基因簇vas和S001中的Ⅱ型PKS基因簇sm3。上述研究为微生物天然产物的基因组挖掘提供了有益借鉴,为更有效激活策略的开发奠定了基础。

关键词：放线菌天然产物基因组挖掘调控基因体外重构异源表达

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