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皮炎外瓶霉遗传多样性研究及体外药敏测试

皮炎外瓶霉遗传多样性研究及体外药敏测试

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作者：陈天杨中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)是一类菌丝和或孢子能产生黑色素的暗色真菌,在自然环境中的分布特性尚不明确,是外瓶霉属中最常见的致病菌。以往认为皮炎外瓶霉主要累及免疫功能低下的人群,如长期使用免疫抑制剂,器官移植... 详细信息

研究背景皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)是一类菌丝和或孢子能产生黑色素的暗色真菌,在自然环境中的分布特性尚不明确,是外瓶霉属中最常见的致病菌。以往认为皮炎外瓶霉主要累及免疫功能低下的人群,如长期使用免疫抑制剂,器官移植术后或患有恶性肿瘤的患者,造成机会性感染。但随着全球范围内皮炎外瓶霉感染病例的不断报道和进一步研究发现,皮炎外瓶霉也常导致免疫功能正常宿主的感染,并且表现出明显的地域、易感人群和菌株遗传多样性的差异,提示不同地域的皮炎外瓶霉菌株可能存在不同的毒力差异及遗传起源。近年来,皮炎外瓶霉感染有明显上升趋势,其感染类型多样,临床表现复杂,早期诊断困难。目前,针对皮炎外瓶霉感染的抗真菌治疗方案尚未达成共识,临床上常被迫进行经验性抗真菌治疗,治疗方案相当混乱,严重影响患者预后。研究目的本研究拟对收集到的皮炎外瓶霉菌株进行全基因组二代测序以及体外药敏实验,在基因组水平上探讨其可能的遗传起源、生态位置及功能差异,明确耐药特征,从而为皮炎外瓶霉的科学防控和精准治疗提供理论基础。研究方法第一,对皮炎外瓶霉环境株和临床株进行分离收集,同时也收集部分外瓶霉属其他种的真菌作为种间对照。第二,使用美国临床实验室标准化协会推荐的M38-A3肉汤微量稀释法对皮炎外瓶霉进行体外药物敏感性试验,明确耐药特征。第三,使用Illumina平台对收集到的所有菌株进行二代测序,结合公共数据库相关菌株数据,对皮炎外瓶霉基因组进行结构和功能注释,并通过系统发育分析来研究皮炎外瓶霉的群体遗传学特征。结果第一部分共收集到来自中国、日本、美国的5株皮炎外瓶霉菌株和来自乌拉圭、俄罗斯、德国的4株外瓶霉属的其他种菌株作为种间对照。此外,收集了NCBI数据库中已公布的全部31株皮炎外瓶霉基因组数据,用于后续分析。第二部分体外药物敏感性实验结果表明艾莎康唑、伏立康唑、两性霉素B对皮炎外瓶霉的抗真菌作用较强,本实验未发现相关耐药菌株。棘白菌素类药物在体外实验中对皮炎外瓶霉的抗真菌作用较差,耐药常见,不推荐作为皮炎外瓶霉感染的一线治疗药物。另外,皮炎外瓶霉对唑类药物的敏感性存在异质性,尤其是对于伊曲康唑和泊沙康唑,因此推荐临床上对皮炎外瓶霉感染患者及时开展唑类药物敏感性测试以提供治疗指导。第三部分参考菌株基因组的功能注释结果表明,外瓶霉属具有嗜芳香烃化合物的独特性质,可能对其环境中的生态龛位有着重要影响。代谢通路功能富集结果在多株菌株上都表现为中枢神经系统疾病的富集,提示这种潜在的嗜神经作用可能在皮炎外瓶霉菌株中普遍存在。系统发育分析结果显示皮炎外瓶霉菌株的遗传多样性具有地理上的差异,亚洲和欧洲的皮炎外瓶霉菌株亲缘关系较近,而美国的皮炎外瓶霉菌株则具有相似的遗传起源,环境株与临床株之间以及不同感染部位来源的皮炎外瓶霉菌株之间的进化差异并不明显。提示环境中的皮炎外瓶霉菌株同样具有潜在的致病能力。结论本研究收集了来自多个国家地区的的皮炎外瓶霉菌株。体外药敏实验结果显示,艾莎康唑、伏立康唑、两性霉素B对本研究收集到的皮炎外瓶霉菌株抗真菌活性较高,棘白菌素类药物抗真菌活性最低,皮炎外瓶霉对唑类药物的敏感性存在异质性。皮炎外瓶霉基因组含有降解单芳香烃化合物的关键酶,有助于预测其在自然环境中的生态龛位。皮炎外瓶霉在代谢通路上表现为神经系统疾病的富集,解释了菌株的嗜神经作用,且这种嗜神经作用可能在皮炎外瓶霉中广泛存在。系统发育分析结果则提示皮炎外瓶霉菌株的遗传多样性具有地理上的差异,环境中的皮炎外瓶霉菌株同样具有潜在的致病能力。

关键词：皮炎外瓶霉体外药物敏感性实验全基因组测序遗传多样性系统发育分析

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基于不同氧环境下抗卵巢癌敏感性化疗药物体外筛查的研究

基于不同氧环境下抗卵巢癌敏感性化疗药物体外筛查的研究

引用

作者：王鑫吉林大学

学位级别：硕士

研究背景卵巢癌发病率为妇科恶性肿瘤第三位,但因其发病隐匿,往往70%左右的患者就诊时就已为III/IV期,5年生存率仅约30～40%,故死亡率居首位。卵巢癌标准的治疗方案为手术加化疗,而目前一线的化疗方案为铂类药物联合紫杉醇。虽然大部分... 详细信息

研究背景卵巢癌发病率为妇科恶性肿瘤第三位,但因其发病隐匿,往往70%左右的患者就诊时就已为III/IV期,5年生存率仅约30～40%,故死亡率居首位。卵巢癌标准的治疗方案为手术加化疗,而目前一线的化疗方案为铂类药物联合紫杉醇。虽然大部分患者在初始治疗时即取得较好的疾病缓解,但仍有部分患者对一线化疗无反应或反应较差。近年来,随着对肿瘤认知的加深以及患者对化疗药物反应的迥异,肿瘤个体化治疗随之提出。目前针对肿瘤个体化治疗的方法多种多样,其中一种方式为人体外化疗药敏实验,虽然目前体外药敏试验取得一定效果,但是与临床的符合度仍有待进一步提高。随着对肿瘤研究的深入,肿瘤微环境逐渐进入人们视野,而其中肿瘤微环境的一大特点即为乏氧。大量的体外实验已经证实,乏氧环境下可引发肿瘤的血管生成、抗凋亡、药物敏感性改变以及肿瘤转移。目前化疗药物敏感实验均基于常氧条件下进行,因此有学者指出药敏试验与实际临床效果不符合原因可能与未能较好模拟肿瘤乏氧微环境有关。故利用肿瘤细胞进行体外化疗药物敏感性实验时,如能同时模拟肿瘤微环境中的缺氧状态,或许能够更好的拟合体内化疗药物杀伤肿瘤细胞的效果。研究目的1、明确常氧环境和乏氧环境下卵巢癌肿瘤细胞的敏感化疗药物是否存在差异,初步探索基于乏氧环境下药物敏感性实验筛选的方法,为今后建立基于乏氧环境下敏感性化疗药物筛选的研究提供一定基础。2、探索常氧环境和乏氧环境下卵巢癌细胞转录组水平变化情况。研究方法1、将2%O+93%N+5%CO的混合气体充入乏氧培养模块进行体外模拟乏氧环境,而常氧环境则为21%O+74%N+5%CO。利用ROS-ID?Hypoxia/Oxidative Stress Detection Kit(乏氧探针)进行SKOV3细胞的乏氧状态判定,利用CCK-8对两种氧气环境中SKOV3细胞进行细胞活力检测并绘制生长曲线。2、构建两种乏氧处理方法作为乏氧条件下药物敏感性筛选实验的备选方案,方案一为直接乏氧法(顺铂与乏氧同时作用于SKOV3细胞72小时),方案二则为乏氧过渡法(乏氧预处理24小时后,加入顺铂于乏氧条件下培养72小时),同时设立两种乏氧处理方法所对应的常氧处理组。利用CCK-8检测各实验组中顺铂的杀伤效果并绘制抑制率曲线,能够导致顺铂杀伤效果显著低于常氧处理组的乏氧处理方法即为后续乏氧条件下药物敏感性筛选的实验方案。3、根据选择的乏氧条件下药物敏感性筛选的实验方案对SKOV3细胞进行常用的一线及二线化疗药物进行筛选,同时设立对应的常氧处理组,利用CCK-8评估化疗药物的杀伤效果并对比乏氧环境下及常氧环境下化疗药物的抑制率有何不同,根据计算的IC50及IC90判定在乏氧环境下及常氧环境下的敏感药物。4、将常氧环境及乏氧环境下生长72小时的SKOV3细胞交由第三方检测公司进行全转录组测序,测序结果返回后,利用***平台进行差异表达基因分析,分别选取5个高表达及低表达基因进行RT-q PCR数据验证,验证无误后利用DAVID在线数据库进行GO及KEGG分析。5、应用SPSS 24进行统计学分析(P敏感药物筛选实验选用乏氧过渡法进行。3、根据IC50及IC90判定在常氧条件下SKOV3对顺铂、卡铂、紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、依托泊苷、米托蒽醌敏感,对洛铂、拓扑替康耐药;而乏氧条件下SKOV3对紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、米托蒽醌为敏感,对卡铂、顺铂、洛铂、拓扑替康、依托泊苷耐药。4、相对于常氧条件下培养者,乏氧培养72小时后的SKOV3细胞共有10653个基因发生表达改变,其中1645个显著差异表达基因表达水平改变超过4倍以上。显著差异表达基因中有999个的表达水平上调改变,而646个呈表达下调改变。5、GO分析结果表明,上调基因参与的生物学过程主要富集于经典糖酵解、血管生成正性调节、血管生成乏氧反应等生物学过程;下调基因则富集于以DNA为模板的转录调节、纤毛形成、DNA损伤刺激的细胞反应、磷脂酰肌醇生物合成过程、正向调节上皮细胞凋亡过程等生物学功能。6、KEGG分析结果表明,上调基因主要富集于PI3K-AKT信号通路、ECM-受体相互作用、HIF-1信号通路等信号通路,而下调基因则主要富集于肿瘤胆碱代谢、氨基酸生物合成等

关键词：卵巢癌乏氧化疗体外药物敏感性实验肿瘤微环境

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