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生物技术通报 2024年第8期40卷 275-287页

作者：马小翔马泽源刘亚月周龙建和羿帆张翼广东海洋大学食品科技学院广东省水产品加工与安全重点实验室广东省海洋生物制品工程实验室广东海洋大学深圳研究院湛江市脑健康相关海洋药物与营养品重点实验室湛江524088 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) 湛江524006 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心大连工业大学大连116034 加州大学圣地亚哥分校斯克里普斯海洋研究所海洋生物技术与生物医药中心美国拉霍亚92093

【目的】丁内酯I是土曲霉(Aspergillus terreus)产生的一种具有多样生物活性的小分子天然产物,对其结构多样性拓展的探索具有重要意义。以一株高产丁内酯I的海洋来源土曲霉C23-3作为基础菌株,研究丁内酯前体小分子类似物和前体合成酶抑... 详细信息

【目的】丁内酯I是土曲霉(Aspergillus terreus)产生的一种具有多样生物活性的小分子天然产物,对其结构多样性拓展的探索具有重要意义。以一株高产丁内酯I的海洋来源土曲霉C23-3作为基础菌株,研究丁内酯前体小分子类似物和前体合成酶抑制剂对其次生代谢的影响。【方法】以海水马铃薯液体培养基为基础培养基,以3种前体小分子类似物和3种对羟基苯丙酮酸的合成酶抑制剂作为化学诱导剂,在静置发酵条件下进行菌株的化学调控培养。采用高效液相色谱、高效液相色谱-离子阱质谱联用及基于质谱的分子网络和数据库挖掘分析次生代谢产物的产量和多样性。【结果】多数前体小分子类似物和合成酶抑制剂对丁内酯I产量均有不同程度抑制,而高浓度的前体小分子类似物3,4-二羟基苯丙酮酸、两种合成酶抑制剂联用及这三者的联用表现出了较强的抑制效果;并且在丁内酯I的合成受到强烈抑制条件下,丁内酯类、土震素类、洛伐他汀类等多类次生代谢产物的合成也下降,但一种环肽类化合物产量超过10倍的大幅提升,可能是菌体对作为群体感应信号及全局性转录因子lae A诱导子的丁内酯I合成受到压制胁迫的一种应激反应,具体机制有待深入研究。【结论】丁内酯I的前体确为对羟基苯丙酮酸,3,4-二羟基苯丙酮酸及对羟基苯丙酮酸合成酶抑制剂可用作抑制丁内酯I合成的小分子工具,以用于仿突变生物合成的进一步探索以获得多样化丁内酯衍生物,也可诱导产生环肽类化合物。

关键词：海洋真菌化学调控仿突变生物合成丁内酯前体类似物合成酶抑制剂 LC-MS/MS 分子网络

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化学调控下海洋土曲霉C23-3的次生代谢产物研究

化学调控下海洋土曲霉C23-3的次生代谢产物研究

引用

作者：马小翔广东海洋大学

学位级别：硕士

背景:海洋真菌因处于高盐、高压、低氧、寡营养的特殊生境,形成独特的新陈代谢机制,可产生大量结构新颖、活性丰富的次级代谢产物,其中不乏一些具有较强抗氧化或乙酰胆碱酯酶抑制活性等防治神经退行性疾病相关的活性成分,为抗AD(Alzhei... 详细信息

背景:海洋真菌因处于高盐、高压、低氧、寡营养的特殊生境,形成独特的新陈代谢机制,可产生大量结构新颖、活性丰富的次级代谢产物,其中不乏一些具有较强抗氧化或乙酰胆碱酯酶抑制活性等防治神经退行性疾病相关的活性成分,为抗AD(Alzheimer’s disease,AD)药物先导化合物提供了丰富的来源。目的:筛选可获得更丰富次生代谢产物的化学调控培养条件,探索新的次生代谢调控方法,拓展芳基丁内酯等重要产物的结构多样性和活性,为发现抗AD活性的药物先导化合物提供基础。方法:以一株高产丁内酯Ⅰ的海洋来源土曲霉C23-3作为出发菌株,对其进行不同策略的化学调控发酵培养,包括多样化小分子化学诱导策略和仿突变生物合成策略:(1)多样化小分子化学诱导策略基于海水马铃薯蔗糖液体培养基和糙米培养基两种基础培养基,采用系列浓度梯度的多样化前体小分子(3-氨基-L-酪氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3,4-二羟基苯丙酮酸、金合欢醇、法尼基二磷酸-三铵盐(Farnesylpyrophosphate,FPP))、氧化胁迫剂(亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)、过氧化氢(HO))和L-硒代蛋氨酸作为化学诱导剂,研究菌株在化学调控培养条件下的菌落形态、薄层层析特征(紫外、荧光、化学显色及生物自显影特征)、HPLC指纹图谱,并基于LC-MS/MS进行次生代谢产物的分子网络分析。(2)仿突变生物合成策略以海水马铃薯蔗糖液体培养基为基础培养基,首先摸索菌株C23-3特征代谢产物丁内酯Ⅰ的生物合成规律,找出丁内酯Ⅰ首个产量突增以及达到峰值的时间;其次采用系列浓度梯度的多样化前体小分子类似物(3-羟基-L-酪氨酸、3,4-二羟基苯丙酮酸、金合欢醇)和对羟基苯丙酮酸的合成酶抑制剂,包括预苯酸脱氢酶抑制剂(1,3-金刚烷二乙酸、N-(对甲苯磺酰)-L-苯丙氨酸)和酪氨酸转氨酶抑制剂(苯乙肼硫酸盐)作为化学诱导剂,采取单独或联合加入前体小分子、酶抑制剂的方式,研究菌株在不同培养条件下的菌落形态、HPLC指纹图谱和丁内酯I产量的变化。结果:(1)多样化小分子化学诱导微量发酵结果表明,9种诱导剂可刺激菌株C23-3代谢产物的种类和产量发生不同程度的变化,其中金合欢醇(1μmol/L)、FPP(5μmol/L)、MSB(10μmol/L)和3-氨基-L-酪氨酸(1 mmol/L)等4种诱导剂效果较好,可刺激菌株产生多样化的丁内酯类化合物和土震素类化合物。常量发酵结果表明,HO对糙米培养基下的菌株C23-3产生氧化胁迫,诱导其产生更高产量的土震素类成分;其他8种诱导条件下菌株代谢产物的TLC指纹图谱多数差异明显但HPLC-DAD指纹图谱变化不大。大量发酵结果表明,MSB(10μmol/L)诱导条件下的菌株代谢产物可能含有一系列丁内酯类化合物。(2)仿突变生物合成策略筛选菌株培养时间的实验结果表明,菌株C23-3的特征代谢产物丁内酯Ⅰ的产量会随培养时间改变而变化,在接种2天时产量剧增,5天时到达峰值。酪氨酸转氨酶抑制剂——苯乙肼硫酸盐对丁内酯I的合成有显著抑制作用;预苯酸脱氢酶抑制剂——1,3-金刚烷二乙酸、N-(对甲苯磺酰)-L-苯丙氨酸单独作用对丁内酯I合成无显著抑制作用,但与苯乙肼硫酸盐联合作用时有剂量依赖的抑制作用,且强于苯乙肼硫酸盐单独作用;小分子前体类似物3,4-二羟基苯丙酮酸在10 mmol/L剂量下对主产物丁内酯I的产生有显著抑制作用。当3,4-二羟基苯丙酮酸与两种酶抑制剂(N-(对甲苯磺酰)-L-苯丙氨酸+苯乙肼硫酸盐)共同作用时,更可极大地抑制丁内酯I的产生。结论:多样化小分子诱导对海洋真菌的次生代谢具有调控作用,可激活其部分沉默基因簇的表达;而4-羟基苯丙酮酸的合成酶抑制剂与3,4-二羟基苯丙酮酸共同作用,可抑制菌株主产物丁内酯I的产生,验证了丁内酯I的生物合成途径,找到了可在真菌体内调控主体代谢产物丁内酯I合成的小分子工具,为仿突变生物合成的进一步研究奠定了初步基础。这些为抗AD活性化合物的发现进行了有益的探索。

关键词：阿尔茨海默症海洋真菌化学调控分子网络仿突变生物合成

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