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医学研究杂志 2008年第4期37卷 19-22页

作者：喻晶杨虹邹德学桂耀庭北京大学深圳医院检验科 518036 北京大学深圳医院中心实验室 518036

目的探讨Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达特征及其功能。方法采用RT-PCR和免疫荧光技术,从基因和蛋白水平检测Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达;以Fura-2/AM为细胞内钙离子荧光指示剂,观察IgA对人支气管平滑肌细胞内钙离子浓度的... 详细信息

目的探讨Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达特征及其功能。方法采用RT-PCR和免疫荧光技术,从基因和蛋白水平检测Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达;以Fura-2/AM为细胞内钙离子荧光指示剂,观察IgA对人支气管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响。结果RT-PCR和免疫荧光染色方法、均检测到Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达。sIgA与人支气管平滑肌细胞孵育90min后,细胞内Ca2+浓度明显增高,差异具有显著性(P人支气管平滑肌细胞孵育90min后,细胞内Ca2+浓度无明显改变(P>0.05)。结论Fca受体在人支气管平滑肌细胞存在表达,sIgA使人支气管平滑肌细胞内钙离子浓度增高。

关键词：人支气管平滑肌细胞 Fca受体细胞内钙

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白介素-13诱导的人支气管平滑肌细胞哮喘模型的蛋白质组学研究

白介素-13诱导的人支气管平滑肌细胞哮喘模型的蛋白质组学研究

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作者：陈淑敏华南理工大学

学位级别：硕士

支气管哮喘(简称哮喘)作为一种常见的慢性气道炎症疾病,其致病诱因和病理机制十分复杂,受遗传与环境因素的双重影响,牵涉到多种细胞、细胞组分和生化过程。尽管关于哮喘的发病机理已有许多研究,但对其发病及发展过程中的关键信号通路仍... 详细信息

支气管哮喘(简称哮喘)作为一种常见的慢性气道炎症疾病,其致病诱因和病理机制十分复杂,受遗传与环境因素的双重影响,牵涉到多种细胞、细胞组分和生化过程。尽管关于哮喘的发病机理已有许多研究,但对其发病及发展过程中的关键信号通路仍存在较多争议。白介素-13(IL-13)是一种第二型辅助T细胞(Th2)细胞因子,多项研究表明它在哮喘发病机制中起关键作用,参与气道炎症、粘膜分泌物、气道高反应性及支气管狭窄的调节等过程,但各项机制尚未完全清楚和达成共识。针对此现状,尤其是已有研究往往只涉及特定分子和通路检测的局限,我们拟定了以蛋白质组学策略对IL-13在哮喘发病和发展过程中之作用进行研究的方针,以期在整体和网络的层面上理解其相关的分子过程。具体来说,本工作(1)首先建立了IL-13诱导的人体气道平滑肌细胞(HBSMC)哮喘模型,(2)利用了基于二维凝胶电泳(2DE)-质谱(MS)的蛋白质组学方法,对IL-13刺激后和哮喘治疗药物β2受体激动剂特步他林(R-Ter)作用下的HBSMC蛋白质组进行了差异分析,(3)对差异蛋白质进行了功能和通路分析,初步讨论了相关的病理和药物机制。本工作首先构建哮喘平滑肌细胞模型,即用50 ng/m L IL-13诱导人支气管平滑肌细胞(human bronchial smooth muscle cell,HBSMC)模拟哮喘炎性环境,给药组则在IL-13诱导1 h分别给0.05μM、1μM及10μM R-Ter,诱导或给药24 h、48 h后分别取细胞(加上对照组共10个组)进行细胞面积测定、增殖测定或提取其可溶性蛋白。实验结果表明与对照组相比,IL-13诱导24 h及48 h后细胞面积均有显著性增加,提示细胞在细胞因子IL-13的诱导下可能有细胞肥大现象产生,给各浓度R-Ter组的细胞面积相对IL-13诱导组均有显著性减小。相对于对照组,IL-13诱导和给R-Ter均不会引起显著的细胞增殖。随后,我们对10个组经超声波破碎提取的可溶性蛋白采用基于―非变性2-DE-选点切胶-nano-UPLC-MS/MS‖的组学策略进行分析:各组可溶性蛋白经非变性微型二维电泳分离后,各自选取1块胶按照设定的选点原则(即IL-13诱导组vs对照组、各浓度R-Ter给药组vs IL-13诱导组、IL-13诱导48 h vs IL-13诱导24 h,三种对比下蛋白质点染色强度有明显差别),选出220个点进行切胶,以标准化程序进行胶内酶解、肽段提取和非标记定量标准品添加后用nano LC-MS/MS进行蛋白质鉴定及非标定量;汇总每块胶对应切取胶粒的蛋白质含量信息,每块胶粒所含蛋白质种类为207种,220个胶点共鉴定到792种蛋白质。组学数据处理依次为:选取每块胶粒中含量排前5的蛋白质(序列同源性超过90%的蛋白质分别进行合并),按上述选点原则寻找差异表达蛋白(共同检测到且含量差异≥1.5倍或≤0.67倍,即上调或下调)。共有89种蛋白质在不同组别比较中发生了表达变化。功能及作用网络等生物信息学分析的结果表明,这些蛋白质涉及到代谢、生理、应激反应、转录-翻译、细胞结构构成等多种细胞过程。其中,与代谢相关酶的变化说明IL-13诱导会使支气管平滑肌细胞糖酵解代谢途径增强而磷酸戊糖途径代谢减弱,整个能量代谢过程加快,给不同浓度R-Ter能一定程度使细胞恢复正常的代谢水平。生理活动相关蛋白的差异表达提示IL-13诱导会使支气管平滑肌细胞的各种生理活动增强,包括抑制错误折叠蛋白质的聚集、蛋白质的分类加工运输等。给不同浓度R-Ter处理后能一定程度下调以上各种蛋白质的表达。此外,应激蛋白的差异表达说明IL-13诱导使得细胞处于异常环境,并可能提示细胞炎症反应的发生。结构蛋白表达变化表明IL-13诱导可能导致细胞骨架不稳定、细胞的收缩性能下降,使细胞呈病理状态。而给R-Ter后能对这种病理状态有所改善。此外,IL-13诱导较长时间会引起细胞内各种蛋白质的翻译增多,细胞的功能性活动有所增强,而给R-Ter能够一定程度改善这种情况,使细胞恢复正常生长水平。IL-13诱导48 h后还发现了1种在其他所有组别中没有表达的蛋白质——POTE锚蛋白结构域家族成员1。POTE基因被鉴定为一类促凋亡蛋白质基因家族,提示在IL-13诱导48 h可能促进细胞凋亡产生。与文献对比可知,以上机理在哮喘的相关研究工作中已多有提及,但本研究是首次从蛋白质组学的角度,无事先假定地进行了系统的分析,较为可靠地揭示了IL-13参与诱导的哮喘疾病涉及到多种细胞过程,并提出了其中表达变化显著的蛋白,为今后进一步的病理研究及药物开发提供了新的线索。除上述工作外,我们还进行了非变性蛋白组学方法学相关研究,并将其应用到大鼠血浆蛋白质全局谱图绘制的非变性组学研究工作中,包括非变性微型二维凝胶电泳

关键词：哮喘差异蛋白质组学 IL-13 人支气管平滑肌细胞非变性二维凝胶电泳定量LC-MS/MS

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TNF-α和IL-1β通过MAPK通路上调人支气管平滑肌细胞的缓激肽受体和内皮素受体

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西北药学杂志 2018年第3期33卷 353-359页

作者：蔡艳杨旭东雷莹西安交通大学第二附属医院药学部西安710004 西安交通大学医学部生物化学与分子生物学系西安710061 深圳华大生命科学研究院深圳518083

目的支气管平滑肌对气道收缩剂的高反应性是哮喘的主要病理表现,但这种现象背后的分子机制尚未明确。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的释放对气道高反应性的发生起重要作用。研究旨在考察促炎性细胞因子TNF-α和IL-1... 详细信息

目的支气管平滑肌对气道收缩剂的高反应性是哮喘的主要病理表现,但这种现象背后的分子机制尚未明确。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的释放对气道高反应性的发生起重要作用。研究旨在考察促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β对缓激肽、内皮素-1和血栓素A2的G蛋白偶联受体(GPCR)在人支气管平滑肌细胞(HBSMCs)中mRNA水平的影响。方法将HBSMCs与炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-13以及MAPK信号通路抑制剂共同培养后,检测缓激肽受体B1和B2、内皮素B受体、血栓素A2受体和β2肾上腺素受体mRNA水平的变化。结果 TNF-α增加了HBSMCs中缓激肽B1和B2受体的mRNA水平,IL-1β增加了HBSMCs中的内皮素B受体的mRNA水平。P38 MAPK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125降低了TNF-α上调的缓激肽受体mRNA水平,MEK1/2抑制剂U0126和IκB激酶抑制剂TPCA-1消除了由IL-1β引起的内皮素B受体的mRNA水平增加。结论 TNF-α通过p38 MAPK和JNK信号通路在转录水平上调缓激肽B1和B2受体,IL-1β通过MEK1/2和下游NF-κB通路在转录水平上调HBSMCs中内皮素B受体。

关键词： TNF-α IL-1β 人支气管平滑肌细胞缓激肽受体内皮素B受体 MAPK

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基于非变性2DE-网格凝胶切取—定量LC-MS/MS的非变性细胞蛋白质组学及规模相互作用分析策略的建立

基于非变性2DE-网格凝胶切取—定量LC-MS/MS的非变性细胞蛋白质组...

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作者：张君华南理工大学

学位级别：硕士

在真实的细胞环境中,蛋白质通过相互作用行使其功能,对蛋白质间相互作用的研究对于理解蛋白质的结构、功能及相关的细胞过程具有极其重要的意义,是目前蛋白质组学及其相关学科研究的热点和难点。本研究选择人体支气管平滑肌细胞(human b... 详细信息

在真实的细胞环境中,蛋白质通过相互作用行使其功能,对蛋白质间相互作用的研究对于理解蛋白质的结构、功能及相关的细胞过程具有极其重要的意义,是目前蛋白质组学及其相关学科研究的热点和难点。本研究选择人体支气管平滑肌细胞(human bronchial smooth muscle cells,HBSMC)水溶性蛋白质组为模型体系,以基于“非变性微型二维凝胶电泳―网格凝胶切取―定量液相色谱串联质谱”接以“非变性蛋白质谱图相似性比较分析”的全新组学策略对该体系进行了全局的鉴定、定量及相互作用分析。具体来说,全局的鉴定和定量分析分为三个部分:(A)HBSMC水溶性蛋白质组的提取和非变性微型二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)进行分离;(B)对凝胶的全局网格切取,将2DE凝胶的主体部分(约30 mm×40 mm)系统地、无差别地划分和切割为1.1 mm×1.1 mm的凝胶方块(厚度为1.0 mm);(C)对所得的972个胶块分别进行胶内酶解,所得肽段经由纳升级超高效液相色谱串联质谱(nano ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,nano-UPLC-MS/MS)分析,再经由蛋白质组学软件处理,得到鉴定及非标记定量分析结果。结果显示:(1)单个方格中检测到的蛋白质种类的数目从2到280不等,平均约80种/方格。在成功分析的967个凝胶方格中,总共检测到了4323种蛋白质。(2)定量LC-MS/MS分析提供了每种蛋白质在每个方格中的含量。据此,可以重构每种蛋白质在凝胶上(972个方格组成)的含量分布,得到其非变性蛋白质谱图(native protein map)。直观观察发现每种蛋白质都有其特征分布,是其在非变性条件(近生理条件)下生化性质和与其它蛋白质相互作用的综合结果,但对这些信息的抽提需要建立多种评估和深度分析方法。鉴于具有稳定相互作用的蛋白质在非变性2DE过程中将以复合物形式泳动,因此应在同一区域得到检测。基于此,我们建立了通过评估蛋白质分布谱图之间相似性(similarity comparison)进而预测蛋白质间相互作用的方法。分布谱图相似性比较的核心是“重合因子”(overlap factor)的定义及其计算的程序化。对在3个及以上方格中有分布的2328个蛋白质的非变性谱图进行了两两比较(共比较近270万次,得到2328行×2328列的重合因子矩阵),当设定重合因子为0.65时,共筛选得到431个蛋白质相互作用对。经过数据库(Uni Prot KB)检索和文献确证,显示其中301个蛋白质相互作用对已有文献报道,共形成35个蛋白质复合物,并预测了一个新的蛋白质复合物在人体中的存在。这些结果充分证明此全新的非变性组学分析策略在细胞蛋白质组相互作用规模化预测上的性能。这不仅是第一次将非变性2DE凝胶上细胞蛋白质的分布可视化,也是第一次通过比较非变性蛋白质谱图相似性分析近生理条件下的蛋白质复合物。我们预计,若使用更为灵敏的质谱时,将能够预测更多低丰度蛋白质相互作用对的存在,进一步扩大该策略的应用深度和广度。在后续工作中,我们还进一步讨论和验证了水溶性蛋白质组分含有相当比例的膜蛋白质(反之亦然),提示若加强对膜蛋白质的溶解,将能进一步扩大该组学策略在细胞全蛋白质组研究中的应用。

关键词：非变性微型二维凝胶电泳―全局网格凝胶切取―定量超高效液相色谱与串联质谱联用分析非变性蛋白质谱图蛋白质间相互作用细胞蛋白质组学人支气管平滑肌细胞

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