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亚抑菌浓度抗生素对***-PA接合反应的影响

作者：袁慧广州中医药大学

学位级别：硕士

目的：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种重要的条件致病菌,是革兰阴性兼性厌氧非发酵菌。抗生素的广泛使用使细菌的耐药性越来越严重。PA的耐药主要分为天然耐药与获得性耐药。天然耐药由染色体介导,通常垂直传播给子代... 详细信息

目的：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种重要的条件致病菌,是革兰阴性兼性厌氧非发酵菌。抗生素的广泛使用使细菌的耐药性越来越严重。PA的耐药主要分为天然耐药与获得性耐药。天然耐药由染色体介导,通常垂直传播给子代细菌,水平传播则很少或无。天然耐药性决定了一个菌种的野生表型。获得性耐药主要有三种机制：一是由于通透性降低或主动外排系统正调节导致到达靶位的抗菌药量减少;二是靶位修饰;三是产生p-内酰胺酶水解抗菌药物。基因的水平传播方式(horizontal gene transfer, HGT)是细菌之间互相交换或接受对方基因,接合(conjugation)是基因水平转移非常重要的途径。群体感应系统(quorum sensing, QS)是细菌重要的信号系统,其作用机制为信号分子进入细胞内与胞内受体结合然后启动相关基因的表达。多种细菌通过感知某种信号分子的浓度来检测周围细菌群体的数量变化,当信号分子达到某一阈值后,就会与一些转录调节子结合,调节相关基因的表达以适应环境变化。根癌土壤杆菌质粒Ti的接合过程需要酰基高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactones, HSL)参与,而HSL是QS系统重要的信号分子。课题组前期研究了HSL在铜绿假单胞菌接合反应中所起的作用,发现在HSL作用下,E. coli-PA接合反应频率增大,HSL通过调节多个接合相关基因的表达促进接合。与HSL相比,抗生素对于细菌而言也是一种信号分子。《Nature》的一篇综述回顾了上个世纪的抗生素研究,认为抗生素是一种良好的探测器,能够帮助人们了解微生物的复杂性。另一方面,人们对于抗生素对于细菌的作用靶点相对了解的比较明确,而HSL涉及到全局的调控系统,具体的机制比较复杂,很难阐明。抗生素也是细菌的次级代谢产物或由其演变而来,抗生素对细菌的作用不仅仅是杀菌或抑菌那么简单。研究发现,细菌的耐药与抗生素的使用密切相关。随着抗生素使用的增加,细菌对抗生素的抗性也随之增加。这种情况不仅限于PA和E. coli等革兰阴性杆菌,革兰阳性球菌亦如此,如在减少红霉素的使用以后,发现A类链球菌抗生素抗性株数量减少。SOS系统或者称为LexA调节子是微生物可诱导的DNA修复系统,lexA蛋白的调控网络系统帮助维持细菌DNA的完整性。已经证实亚抑菌浓度的抗生素可以激活SOS反应,有相关的文献报道抗生素对铜绿假单胞菌的作用与激活SOS反应相关。SOS反应跟细菌的接合的关系又是什么呢?细菌的接合这种生理行为涉及到细菌的很多调控系统,会不会与SOS的调控网络有很重要的相关性?我们有很多佐证,但是对于铜绿假单胞菌来说,详细的机制未明。本课题拟从铜绿假单胞菌临床常用的抗生素的亚抑菌浓度入手,先探索亚抑菌浓度的抗生素在铜绿假单胞菌的接合反应中所起到的作用。众所周知,抗生素具有抑制乃至杀灭细菌的作用,那怎么推测它具有促进耐药基因水平转移的作用呢?其实这并不矛盾,因为抗生素发挥作用的前提是要达到有效药物浓度及作用时间。通常抗生素对细菌的作用具有浓度和时间依赖性,所以为达到抑制甚至杀灭细菌的作用,临床应用抗生素时需根据药物代谢动力学参数定时定量给药,以维持抗生素浓度大于最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。然而,实际上有多种因素导致到达感染部位的抗生素仅达到“亚MIC"(sub-MIC)水平,其中不规范用药是一个重要原因;其次,细菌可形成了特殊结构,比如PA形成生物膜抵御抗生素;第三,人体器官的特殊结构,如血脑屏障可阻止某些药物进入脑室;第四,因药物在不同组织器官中的分布情况不同,以及受感染组织的血液供应欠佳等;第五,细菌虽然被人体吞噬细胞吞噬,但因机体免疫力较低而未被杀灭,反而吞噬细胞成为了细菌的庇护所。在亚MIC水平,抗生素杀灭不了细菌。本课题拟从临床常用抗生素的亚抑菌浓度入手,探索亚抑菌浓度的抗生素在铜绿假单胞菌接合反应中所起的作用及相应的分子机制。本课题拟从以下三方面展开研究：(1)首先优化课题组前期建立的供体菌***与受体菌PA的接合模型,使之适合抗生素的处理研究;(2)观察比较抗生素对供体菌及受体菌的不同影响,然后研究亚MIC浓度抗生素对细菌接合反应的影响;(3)采用转录组测序技术(RNA-Seq)研究亚MIC抗生素作用下细菌的差异表达基因,筛选接合反应相关基因,进行相关通路的功能分析,并用荧光定量PCR验证转录组学的结果,从而全面阐明亚MIC抗生素对细菌接合反应的影响。方法：1.优化接合反应模型①供体菌与受体菌供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T),受体菌PAO1由美国罗

关键词：铜绿假单胞菌大肠埃希菌SM10λpir(pUCP24T) 亚抑菌浓度接合反应

亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响研究

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亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响研究

作者：卢忠义遵义医学院

学位级别：硕士

目的：研究亚抑菌浓度(subminimal inhibitory concentration,sub-MIC)抗生素对细菌生物膜形成的影响,为探讨细菌生物膜形成的调控机制及发现新的药物靶点提供理论及实验依据。方法：选取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的临... 详细信息

目的：研究亚抑菌浓度(subminimal inhibitory concentration,sub-MIC)抗生素对细菌生物膜形成的影响,为探讨细菌生物膜形成的调控机制及发现新的药物靶点提供理论及实验依据。方法：选取铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的临床分离菌株(PA.11、 PA.12、PA.14)和标准菌株(PAO1、ATCC27853)。采用微量肉汤稀释法测定亚胺培南西司他丁钠(IM/CI)、头孢他啶(CAZ)、哌拉西林舒巴坦钠(P/S)、头孢曲松钠(CRO)、头孢噻肟(CTX)、阿莫西林氟氯西林钠(A/F)的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。分别将1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC抗生素作用于PA,通过细菌黏附力试验了解抗生素对细菌黏附力的影响。选用1/4MIC抗生素作用于PA.12,通过运动试验、菌落计数法、结晶紫染色法及激光共聚焦显微镜(Confocal LaserScanning Microscope, CLSM)观察1/4MIC抗生素对PA.12生物膜形成的影响,同时采用RT-PCR对生物膜形成相关基因algC、alg D进行检测分析。结果：1.细菌黏附力试验结果显示：(1)1/2MIC IM/CI、CAZ、P/S、CRO、CTX能增强PA.11的黏附力,1/2MIC CAZ、CTX能增强PAO1的黏附力,1/2MIC A/F均能增强5株PA的黏附力(p≤0.05)。(2)除1/4MIC CAZ对PA.14黏附力无影响外,其余1/4MIC、1/8 MIC抗生素均能增强PA黏附力(p≤0.05)。2.选取1/4MIC抗生素作用于PA.12,与无药对照组比较：(1)运动试验结果显示：1/4MIC IM/CI、CRO、CTX能增强PA.12的游动能力(p≤0.05);1/4MIC M/CI、CAZ, P/S、CRO、A/F能增强PA.12的群集运动能力(p≤0.05)。(2)菌落计数法结果显示1/4MICIM/CI、P/S、CRO、CTX组PA.12活菌数量明显增多(p≤0.05)。(3)结晶紫染色法显示1/4MICM/CI、P/S、CRO、CTX能诱导PA.12生物膜形成(p≤0.05)。(4)CLSM观察显示1/4MIC IM/CI、P/S、CRO、CTX诱导PA.12生物膜形成增多,厚度增加。(5)RT-PCR结果显示各抗生素均能增强algC基因表达(p≤0.05),IM/CI、P/S诱导algD基因表达增强(p≤0.05)。结论：1/4MIC IM/CI、P/S、CRO、CTX能诱导PA.12生物膜形成,1/4MIC CAZ、A/F对细菌生物膜形成没有影响;1/4MIC IM/CI、CAZ、P/S、CRO、CTX、A/F对铜绿假单胞菌群体感应(quorum sensing, QS)系统具有调节作用。

关键词：铜绿假单胞菌亚抑菌浓度最小抑菌浓度 β-内酰胺类抗生素生物膜

亚抑菌浓度抗生素对野生黑颈长尾雉源大肠杆菌耐药基因水平传播效率的影响

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亚抑菌浓度抗生素对野生黑颈长尾雉源大肠杆菌耐药基因水平传播效...

作者：李云飞广西师范大学

学位级别：硕士

近年来,随着抗生素使用量的增加,细菌的耐药性逐渐增强、获得耐药性的速度逐渐加快,甚至出现了能够耐受大多数抗生素的“超级细菌”。因此人们更多地关心抗生素的杀菌效率,但对亚抑菌浓度抗生素对细菌耐药性传播效率的影响少有关注。本... 详细信息

近年来,随着抗生素使用量的增加,细菌的耐药性逐渐增强、获得耐药性的速度逐渐加快,甚至出现了能够耐受大多数抗生素的“超级细菌”。因此人们更多地关心抗生素的杀菌效率,但对亚抑菌浓度抗生素对细菌耐药性传播效率的影响少有关注。本文通过对野生黑颈长尾雉源大肠杆菌耐药性、携带的可移动遗传元件及几种常用的抗生素在亚抑菌浓度条件下对耐药基因传播效率的影响进行研究,了解野生状态下大肠杆菌的耐药性,并对该野生雉类的人工驯养回放保护性措施可能引起的耐药性传播风险及亚抑菌浓度抗生素对耐药基因水平传播效率的影响的评价提供资料。采集广西百色市田林县野生黑颈长尾雉自然分布区野生黑颈长尾雉新鲜粪便,并利用显色培养基分离筛选大肠杆菌;以苹果酸脱氢酶基因(mdh)特异性引物对所分离大肠杆菌进行鉴定,并对其16S rRNA进行扩增验证;对所分离的大肠杆菌肠杆菌基因间保守重复序列进行PCR (ERIC-PCR)分析剔除重叠菌株;利用Kirby-Bauer法(K-B纸片法)对所获得的不同ERIC指纹型大肠杆菌菌株的耐药性进行检测;经聚合酶链反应(PCR)检测所获得的ERIC指纹型大肠杆菌菌株所携带的可移动遗传元件;以原位杂交方法确定其中一株大肠杆菌的四环素耐药基因类型及存在位置;通过在含有不同浓度抗生素的培养基中混合培养大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌的方式检测亚抑菌浓度抗生素对大肠杆菌耐药基因传播效率的影响。结果如下：(1)本研究利用大肠杆菌显色培养基从5份粪便样品中分离到100株大肠杆菌,mdh基因检测并经16S rRNA验证,排除其中2株非大肠杆菌。可见该显色培养基筛选大肠杆菌的准确率可达98%。(2)对98株大肠杆菌进行ERIC-PCR检测,共获得17个ERIC指纹型。当聚类重新标定距离为15时,可被分为4个类群。表明本研究中采集的野生黑颈长尾雉粪便内大肠杆菌种群结构较复杂。(3)药敏实验结果显示p内酰胺类及四环素类抗生素对所分离大肠杆菌抑制效果较差,其中青霉素G对所分离大肠杆菌无抑制作用,头孢曲松耐药株占11.76%,所有菌株对四环素均不敏感;相反,喹诺酮类、脂肽类及氨基糖苷类抗生素具有很好的抑菌效果,喹诺酮类抗生素环丙沙星和氧氟沙星的抑菌率分别高达88.24%和76.47%,多粘菌素B的抑菌也达到82.35%。(4)17个ERIC指纹型大肠杆菌中耐受4种抗生素的菌株占35.30%(6/17),耐受3种的占29.40%(5/17),耐受2种及以下的仅占35.30%(6/17)。所有菌株均对至少一种抗生素具有抗性。若不考虑革兰氏阴性菌对青霉素G天然耐受这一因素,则在所有耐药菌株中,未出现可以同时耐受3类及以上抗生素的“超级细菌”。(5)17个ERIC指纹型大肠杆菌中均检测到F质粒遗传标记traA与整合子遗传标记intl,并检出5种大小不同的1类整合子可变区但不含耐药基因盒的片段;未检出traF、 int Ⅱ、intⅢ及Int-Tn遗传标记。表明菌株携带的可移动遗传元件种类虽然较单一,但仍然具有传播与获得耐药基因的风险。(6)15号大肠杆菌E15所含强力霉素耐药基因为tetB。该基因存在于质粒上但其并非F质粒,共培养时此基因可转移至产酸克雷伯氏菌突变株TR-M30-1。在培养基中共培养时,传播效率与硫酸卡那霉素和氨苄青霉素的亚抑菌浓度呈正相关(P浓度无显著性相关;在模拟自然条件中,传播效率与上述药品浓度间均无显著相关性。

关键词：亚抑菌浓度抗生素黑颈长尾雉大肠杆菌耐药基因传播效率

亚抑菌浓度抗生素对蓝细菌聚集及生物膜形成的影响机制研究

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亚抑菌浓度抗生素对蓝细菌聚集及生物膜形成的影响机制研究

作者：谭琳睿山东大学

学位级别：硕士

抗生素的广泛、大量使用,导致其进入生态环境。近年来,由于抗生素的生物学效应,对其研究已不止局限于作为一种污染物。抗生素如何影响微生物的生理机能,以及微生物对抗生素的耐受机制受到了广泛关注。据报道,在环境中检出的抗生素多为... 详细信息

抗生素的广泛、大量使用,导致其进入生态环境。近年来,由于抗生素的生物学效应,对其研究已不止局限于作为一种污染物。抗生素如何影响微生物的生理机能,以及微生物对抗生素的耐受机制受到了广泛关注。据报道,在环境中检出的抗生素多为亚抑菌浓度。与高浓度抗生素的效能相比,亚抑菌浓度抗生素对微生物生理活动的影响不仅为抑菌性,还将作为信号分子改变微生物的群居性、运动性、抗压性和生物膜形成,并促进微生物之间的协作或竞争关系。目前,国内外研究主要集中在致病菌及模式微生物与抗生素的相互作用,而很少有研究考察环境中亚抑菌浓度抗生素对具有生态效应的微生物的影响。蓝细菌作为一种典型的,具有重要生态环境效应的功能微生物,既是全球碳循环的主要承担者;同时可能在富营养化水体中过度增殖导致水华或赤潮。鉴于蓝细菌在生态环境中的重要作用,结合亚抑菌浓度抗生素在自然环境中广泛存在的现状,亚抑菌浓度抗生素与蓝细菌之间的相互作用机制具有重要的研究意义。本研究主要内容与结果如下：（1）本章研究选用两种典型的抗生素（卡那霉素和妥布霉素）作为研究对象,考察了对细长聚球藻聚集的影响。结果表明,当培养体系中存在亚抑菌浓度抗生素时,细长聚球藻聚集率有所提高。当抗生素浓度为0.1μg/ml时,聚集率明显提高30%～40%。相似的现象在短时接触（24 h）实验中也有存在。通过分析表面性质发现,在亚抑菌抗生素存在情况下,细长聚球藻的表面电荷、亲疏水性及形态均发生改变,而这些变化导致聚集的增加。研究进一步分析了胞外聚合物中胞外蛋白和多糖的相对含量,发现抗生素的存在改变胞外蛋白的分泌量,导致细长聚球藻表面性质的变化,进而影响聚集。为了进一步模拟在自然水体中亚抑菌浓度抗生素对细长聚球藻的作用,本研究考察了pH和离子强度的影响。结果表明,在较低pH和离子强度下,细长聚球藻的聚集能力更易受抗生素的影响。（2）铜绿微囊藻过量生长是导致水华的重要原因。因此,本研究进一步考察了亚抑菌浓度抗生素对铜绿微囊藻聚集的影响。结果表明,在0.02μg/ml卡那霉素或0.01 μg/ml妥布霉素浓度下,铜绿微囊藻聚集率分别增加约14.9%和25.4%。经表面性质分析发现,表面电荷和亲疏水性只发生了微弱的变化。在短时接触实验中,铜绿微囊藻与抗生素作用后聚集率和表面性质均未发生明显变化。这一方面说明了表面性质在聚集中的重要作用;另一方面表明,在亚抑菌浓度抗生素存在条件下,不同蓝细菌菌株有着不同的生理变化。（3）微生物的聚集是生物膜形成的第一步,结合第二章研究结果,本章研究以细长聚球藻为研究对象,考察了亚抑菌浓度卡那霉素对其生物膜形成的影响,并通过转录分析考察其生态效应。结果表明,O.05～0.1 μg/mL卡那霉素能够促进蓝细菌生物膜的形成。通过对细长聚球藻的表面性质及形态分析发现,胞外蛋白对于调节生物膜形成起重要作用,且蓝细菌形态的变化也对生物膜形成产生影响。同时,通过对抗生素存在条件下蓝细菌的1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶及碳酸酐酶的转录分析,发现两种酶的表达均发生了变化。综合细长聚球藻生物膜及酶表达量的变化,我们推断在亚抑菌抗生素存在情况下,由蓝细菌介导的生物钙化作用可能提高,而钙化过程的提高可能间接引起大气中二氧化碳浓度的提高,产生较大的生态效应。

关键词：亚抑菌浓度抗生素蓝细菌聚集生物膜

亚抑菌浓度多肽类药物促进质粒接合转移的机制研究

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亚抑菌浓度多肽类药物促进质粒接合转移的机制研究

作者：曾福鑫扬州大学

学位级别：硕士

细菌抗生素耐药性严重威胁着人类和动物的健康。尤其是质粒介导的耐药性在水平方向上的传播,使危害范围不断扩大。质粒的接合转移可受某些物质促进或抑制的影响。其中促进接合转移的物质均有使细胞膜通透性增强的特性。而多肽类药物多... 详细信息

细菌抗生素耐药性严重威胁着人类和动物的健康。尤其是质粒介导的耐药性在水平方向上的传播,使危害范围不断扩大。质粒的接合转移可受某些物质促进或抑制的影响。其中促进接合转移的物质均有使细胞膜通透性增强的特性。而多肽类药物多粘菌素E和万古霉素发挥抗菌效力的机制便是影响细胞膜的通透性。基于此,我们预测多肽类药物可能会对质粒的接合转移产生影响,进而影响耐药基因的水平传播。因此我们建立了质粒的接合转移模型,并探索了这两种药物对接合转移的影响,同时使用野生型质粒对其功能进行了验证,最后初步探索了多粘菌素E和万古霉素影响质粒转移的潜在机制。用*** J53作为受体菌及携带RP4-7质粒的*** DH5α为供体菌,建立质粒接合转移模型。然后用不同亚抑菌浓度的多粘菌素E和万古霉素分别处理RP4-7质粒的接合转移过程。结果显示,多粘菌素E浓度为1/8MIC时,质粒接合频率达9.84×10-4,是空白对照的38倍;万古霉素浓度为1/4MIC时,质粒的接合频率提高了 3倍,达到8.67×10-5。上述数据说明,亚抑菌浓度的多黏菌素E和万古霉素可促进RP4-7质粒的接合转移。为了解药物在临床中对接合转移的影响,测定了药物对携带重要耐药基因的野生型质粒IncI2质粒(携带mcr-1基因)和IncX3质粒(携带blaNDM-5基因)接合转移的影响。结果显示,多黏菌素E在1/4MIC和1/8MIC浓度时,可显著提高IncI2质粒和IncX3质粒的接合频率,尤其是IncI2质粒的接合频率被提高了超过10倍。万古霉素对IncX3质粒的转移无影响,在1/8MIC浓度下对IncI2质粒的接合频率提高了近10倍。为初步探索多黏菌素E和万古霉素影响质粒转移的机制。首先通过扫描电镜观察到药物处理后的细菌表面有局部破损。然后用荧光探针PI和NPN对细胞膜通透性检测,发现药物作用下的细菌细胞膜通透性增加。其次,还测定了药物作用后细菌细胞内ROS的变化情况,发现万古霉素在1/4MIC时引起受体菌(*** J53)内ROS含量增加。最后,我们应用qPCR技术从分子层面分析了药物作用后细菌内部相关基因的表达变化。ompC和ompF基因分别编码了与渗透压有关的外膜孔蛋白,在低渗条件下ompF表达量增加,ompC则相反。基因表达测定结果显示ompC和ompF的表达分别呈现相对的下调和上调,这与用荧光探针检测的细胞膜通透性增加的结果一致,都说明细胞膜通透性增加。同时对调控细菌间形成连接的trbBp基因,以及抑制trbBp基因表达的质粒转移整体调控基因(korA、korB、trbA)的表达变化进行测定。实时荧光定量结果显示,korA、korB、trbA等基因表达下调,trbBp的表达呈上调趋势。因此说明药物抑制整体调控基因的表达,从而促进trbBp调控细菌间形成连接。综上所述,亚抑菌浓度下多黏菌素E和万古霉素能够促进质粒转移,其主要原因是药物对细胞膜形态产生影响且增加了细菌细胞膜通透性,其次是在药物作用下与质粒转移相关基因的表达发生变化,尤其是药物对细菌间形成接合配对关系有关的基因表达有促进作用。本次研究证明了亚抑菌浓度多黏菌素E和万古霉素对质粒在大肠杆菌中的转移有促进作用。提示亚抑菌浓度多肽类药物不但对相应耐药基因产生富集作用,也可能通过促进质粒的接合转移而加速其他类耐药基因的传播,结果为相关药物风险评估提供相应数据。同时提示我们应该加强相应药物的管控,及残留监测,避免耐药性的传播。

关键词：亚抑菌浓度多黏菌素E 万古霉素质粒转移

亚抑菌浓度β内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌α溶血素的表达调控作用

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亚抑菌浓度β内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌α溶血素的表达调控作...

作者：姚蕾安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨亚抑菌浓度β内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)致病物质α溶血素(Alpha hemolysin,Hla)表达的调控作用及其调控机制。方法:①实验金黄色葡萄球菌菌株分别收集于安徽医科大学第一附属医院检验科培养临... 详细信息

目的:探讨亚抑菌浓度β内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)致病物质α溶血素(Alpha hemolysin,Hla)表达的调控作用及其调控机制。方法:①实验金黄色葡萄球菌菌株分别收集于安徽医科大学第一附属医院检验科培养临床标本,质控菌株选用金黄色葡萄球菌ATCC29213;选择青霉素、头孢西丁、头孢他啶、头孢唑啉作为β内酰胺类代表药物,肉汤稀释法分别测定实验细菌对选用药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);②实验金黄色葡萄球菌菌株经过培养8h后,分别收集细菌与培养上清。荧光定量PCR检测细菌α溶血素mRNA的表达变化,免疫印迹法检测细菌培养上清中α溶血素蛋白的表达变化,红细胞溶血实验检测细菌培养上清中溶血活性的水平变化;③取金黄色葡萄球菌溶血活性表达较强的菌株,分别在培养的同时加入1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC亚抑菌浓度的β内酰胺类药物,分为青霉素、头孢西丁、头孢他啶和头孢唑啉作用组;平板菌落计数法计数绘制生长曲线,组设立4h、8h、12h和24h四个培养观察时间点,分别检测细菌与培养上清中α溶血素表达变化,以及细菌培养上清中溶血活性的水平变化;以未加入药物培养的细菌作为正常对照。④荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌转录调控因子AgrA在亚抑菌浓度β内酰胺类药物作用下的表达变化。结果:①不同金黄色葡萄球菌菌株之间α溶血素mRNA转录水平、上清中的蛋白翻译水平的表达量以及培养上清的溶血活性存在差异;②1/8MIC、1/4MIC亚抑菌浓度β内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌生长无明显抑制作用,可显著上调细菌α溶血素的表达;作用8h后,即可显著上调α溶血素mRNA、上清中蛋白的表达,提高培养上清对红细胞的溶血作用;③亚抑菌浓度β内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌作用后,可显著上调细菌转录调控因子AgrA的表达,结果显示可通过AgrA上调α溶血素mRNA的表达。结论:亚抑菌浓度β内酰胺类药物能够显著上调金黄色葡萄球菌致病物质α溶血素的表达,其机制可能通过细菌转录调控因子AgrA的表达调控。

关键词：金黄色葡萄球菌 α溶血素 β内酰胺类药物亚抑菌浓度

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抗菌药物亚抑菌浓度及其临床意义

中国感染与化疗杂志 2017年第5期17卷 597-601页

作者：王方舟倪文涛崔俊昌中国人民解放军总医院呼吸内科北京100853

随着抗生素的广泛应用,细菌的耐药性越益严重,而新抗生素的研发速度却在明显下降,这使得细菌耐药,尤其是多重耐药成为目前威胁人类健康严重的公共卫生问题。为了抑制细菌耐药的产生和发展,制定临床合理的抗生素应用策略,了解细菌耐药产... 详细信息

随着抗生素的广泛应用,细菌的耐药性越益严重,而新抗生素的研发速度却在明显下降,这使得细菌耐药,尤其是多重耐药成为目前威胁人类健康严重的公共卫生问题。为了抑制细菌耐药的产生和发展,制定临床合理的抗生素应用策略,了解细菌耐药产生机制就显得尤为重要。

关键词：亚抑菌浓度最小选择浓度细菌耐药

亚抑菌浓度美罗培南影响鲍曼不动杆菌毒力特征及与QS系统相关性的初步研究

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亚抑菌浓度美罗培南影响鲍曼不动杆菌毒力特征及与QS系统相关性的...

作者：崔卓异吉林大学

学位级别：硕士

鲍曼不动杆菌是在当前世界范围内引起院内感染的重要病原菌之一,因其耐药性和致病性与日俱增对人类健康造成极大威胁。近年相关研究显示,包括美罗培南在内的多种抗菌药物临床常用给药剂量在治疗鲍曼不动杆菌感染过程中多处于亚抑菌浓度... 详细信息

鲍曼不动杆菌是在当前世界范围内引起院内感染的重要病原菌之一,因其耐药性和致病性与日俱增对人类健康造成极大威胁。近年相关研究显示,包括美罗培南在内的多种抗菌药物临床常用给药剂量在治疗鲍曼不动杆菌感染过程中多处于亚抑菌浓度状态,而亚抑菌浓度抗菌药物不仅对细菌的耐药性、形态、群落结构等产生影响,还可以通过影响细菌毒素产生、运动能力、黏附性等而使细菌的毒力发生显著改变。群体感应是广泛存在于细菌中协调自身群体行为的一种调控机制,这种机制参与细菌毒力以及致病性等多种生物学功能的调节。而目前关于亚抑菌浓度抗生素的压力胁迫作用、细菌毒力和群体感应系统之间相关性的研究尚少见报道。因此,本研究基于我省分离的鲍曼不动杆菌临床分离株,在耐药性检测的基础上,探讨了亚抑菌浓度美罗培南对鲍曼不动杆菌重要毒力特征如生物膜形成、表面运动性和大蜡螟体内致病性的影响及其与群体感应系统的相关性。从而为合理应用抗菌药物、有效控制鲍曼不动杆菌感染及筛选新的药物靶标提供理论参考。研究方法与结果:(1)鲍曼不动杆菌临床菌株耐药特征:本研究收集并鉴定吉林省院内感染的鲍曼不动杆菌临床分离株共60株,通过K-B纸片法测定了菌株对18种抗菌药物的敏感性,并通过微量稀释法测定了所有分离株对美罗培南的最低抑菌浓度(MIC),明确了菌株的耐药特征。结果显示:60株鲍曼不动杆菌临床分离株对β内酰胺类药物的耐药率高达70%3.33%,其中氨苄西林耐药率最高;碳青霉烯类药物美罗培南和亚胺培南的耐药率分别达到了60%和71.67%,对氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物的耐药率也均超过了50%;对四环素类药物中的米诺环素和多肽类药物多粘菌素B尚保持较高敏感性。60株菌中有48株(80%)被确定为多重耐药株。有35株(58.33%)对美罗培南具有耐药性,其MIC测定范围为8-64μg/ml;25株(41.67%)对美罗培南敏感,MIC测定范围为0.25-2μg/ml。(2)亚抑菌浓度美罗培南对鲍曼不动杆菌临床分离株生物膜形成能力的影响:分别应用1/2MIC及1/4MIC美罗培南作用于上述鲍曼不动杆菌临床分离株,利用结晶紫半定量方法检测菌株生物膜形成能力。结果显示:与不加药组相比,美罗培南耐药株在1/2MIC美罗培南作用下菌株生物膜形成能力显著被抑制;而美罗培南敏感株亚抑菌浓度美罗培南作用下,各组之间生物膜形成能力无显著性差异。(3)亚抑菌浓度美罗培南对鲍曼不动杆菌临床分离株表面运动性的影响:应用细菌运动性检测培养基测定不同亚抑菌浓度美罗培南作用下细菌的表面运动性。结果显示:在无抗生素作用下,60株分离株中有5株具有较显著的表面相关运动能力。在1/2MIC美罗培南作用下,与不加药组相比该5株菌运动能力均显著下降。(4)亚抑菌浓度美罗培南对鲍曼不动杆菌对大蜡螟致病性的影响:分别将1/2MIC及1/4MIC美罗培南作用于各鲍曼不动杆菌临床株,应用大蜡螟感染模型观察菌株的体内致病性。结果显示:美罗培南敏感株在1/2MIC及1/4MIC美罗培南作用下对大蜡螟的致病性显著增强,而美罗培南耐药株在亚抑菌浓度美罗培南作用下对大蜡螟的致病性无显著改变。(5)鲍曼不动杆菌群体感应系统与亚抑菌浓度美罗培南作用的相关性:应用生物传感菌检测鲍曼不动杆菌群体感应信号分子AHLs的产生情况,并分析其与亚抑菌浓度美罗培南作用的相关性。结果显示:60株鲍曼不动杆菌中有21株检出AHLs产生。在亚抑菌浓度美罗培南作用下AHLs产生情况发生改变,但结果不一。进一步比较AHLs组与AHLs组菌株在不同亚抑菌浓度美罗培南作用下生物膜形成能力及大蜡螟致病性的变化情况,发现在1/2MIC美罗培南作用下,AHLs组的生物膜形成能力显著下降,而AHLs组的生物膜形成能力无显著改变;在1/2MIC和1/4MIC美罗培南作用下,AHLs组大蜡螟致病性增加更为显著。结论:(1)亚抑菌浓度美罗培南可显著降低美罗培南耐药的鲍曼不动杆菌的生物膜形成能力;显著抑制菌株表面相关运动能力;显著增加美罗培南敏感的鲍曼不动杆菌对大蜡螟的致病性。(2)亚抑菌浓度美罗培南可影响鲍曼不动杆菌群体感应信号分子的产生,群体感应系统可能参与了亚抑菌浓度美罗培南对鲍曼不动杆菌生物膜形成及致病性的调控。

关键词：鲍曼不动杆菌亚抑菌浓度美罗培南毒力群体感应

亚抑菌浓度抗生素对高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因表达的影响

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亚抑菌浓度抗生素对高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因表达的影响

作者：宋国滨安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae,Hv KP）是最近几年在临床分离率越来越多的菌株,因其菌落形态呈现高黏液表型,很多学者将肺炎克雷伯菌的菌落呈现该高黏液表型作为高毒力肺炎克雷伯菌的重要标志。值得关... 详细信息

背景:高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae,Hv KP）是最近几年在临床分离率越来越多的菌株,因其菌落形态呈现高黏液表型,很多学者将肺炎克雷伯菌的菌落呈现该高黏液表型作为高毒力肺炎克雷伯菌的重要标志。值得关注的是,在临床抗感染工作中,进入患者体内的血药浓度因受到很多因素的影响（给药方式、给药剂量、给药途径等）,使菌株常常处于亚抑菌抗生素浓度的作用下,进而会影响细菌的生命活动,改变其病原学行为,但目前较多的研究主要集中在亚抑菌浓度抗生素对肺炎克雷伯菌生物膜形成以及耐药性的影响,对高毒力肺炎克雷伯菌处于亚抑菌浓度抗生素作用下,毒力基因变化研究较少,因此本课题着重于这一点进行研究探讨。目的:研究在亚抑菌浓度抗生素作用下,高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因表达水平的变化,同时对菌株的荚膜血清型、相关毒力基因,菌株之间的同源性进行分析。方法:采用纸片扩散法、vitek2-compact仪器法测定菌株对临床常用抗菌药物的敏感性,并用微量肉汤稀释法检测菌株对头孢西丁和阿米卡星的MIC值。聚合酶链式反应（PCR）对荚膜血清型（K1,K2,K5,K20,K54,K57）及毒力相关基因（rmp A,aerobactin,Kfu,all S,mag A,wca G,fim H,mrk D）进行检测。运用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC浓度头孢西丁、阿米卡星对菌株处理后毒力基因相对表达量的改变并用SPSS软件对其差异进行比较分析,通过基质辅助激光解吸电离飞行质谱（MALDI-TOF MS）及ERIC-PCR检测菌株之间的同源性。结果:共收集57株高毒力肺炎克雷伯菌,对大多数临床常用抗生素保持敏感,PCR结果显示K1型有17株,K2型21株,K20型2株,K57型8株,有9株未检出血清型。rmp A、aerobactin基因检测全部阳性,wca G、Kfu、mag A三个基因分别检出17株、21株、16株。fim H、mrk D全部阳性。亚抑菌浓度头孢西丁及阿米卡星作用下,与对照组相比,三种浓度（1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC）的两个抗生素对两种毒力基因均有明显的抑制作用（P＜0.05）,头孢西丁的抑制程度最高。三种浓度抗生素对细菌的抑制程度相比,以1/2MIC抗生素抑制效果最强。ERIC-PCR将57株菌株分为19型,用A-S来表示,MALDI-TOF MS按照蛋白图谱相似性≥70%标准将57株菌株分为3型,用Ⅰ-Ⅲ来表示,两者结果一致,显示菌株之间亲缘关系较远,其结果具有普遍意义。结论:高毒力肺炎克雷伯菌对临床常用抗生素有较高的敏感性,血清型K1,K2是高毒力肺炎克雷伯菌的常见血清型,在亚抑菌浓度头孢西丁,阿米卡星作用下,rmp A、aerobactin毒力基因表达下降。

关键词：亚抑菌浓度高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因