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乳铁蛋白修饰的人参皂苷Rg3纳米脂质载体经鼻药动学研究

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乳铁蛋白修饰的人参皂苷Rg3纳米脂质载体经鼻药动学研究

作者：李姗姗吉林大学

学位级别：硕士

人参皂苷Rg3是我国传统中草药人参的重要活性成分之一,“参一胶囊”是目前唯一上市的用于提高抗肺癌和肝癌疗效的人参皂苷Rg3单体成分药。人参皂苷Rg3对脑胶质瘤的抑制作用已得到证实,但其水溶性差,口服给药存在肝首过作用。如何跨过血... 详细信息

人参皂苷Rg3是我国传统中草药人参的重要活性成分之一,“参一胶囊”是目前唯一上市的用于提高抗肺癌和肝癌疗效的人参皂苷Rg3单体成分药。人参皂苷Rg3对脑胶质瘤的抑制作用已得到证实,但其水溶性差,口服给药存在肝首过作用。如何跨过血脑屏障(blood brain barrier,BBB),实现向脑内安全高效靶向递送,成为人参皂苷Rg3发挥抗脑肿瘤功效的关键。鼻腔给药无创便捷,可绕过血脑屏障实现脑靶向,成为中枢神经系统(central nervous system,CNS)药物给药途径的研究热点。但普通药物制剂在鼻腔滞留时间短,易被鼻黏膜环境降解或刺激鼻黏膜及损伤鼻纤毛,药物的理化性质和制剂因素严重影响鼻腔给药的药物入脑效率。纳米脂质载体可以增强所搭载药物的释放可控性和靶向性,并具有高包封率、高载药量和低毒性等优势。为了增强纳米脂质载体的靶向性,使用可以和上皮细胞、脑内皮细胞表面受体结合的乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)进行修饰,使带负电的纳米脂质载体转变为正电荷,可以更好地与带负电的鼻粘膜接触。目的:本课题拟制备乳铁蛋白修饰的人参皂苷Rg3纳米脂质载体(Lactoferrin Modified Ginsenoside Rg3 nano lipid carrier,Lf-Rg3-NLC),通过乳铁蛋白的介导,达到增强将人参皂苷Rg3靶向输送至脑的目的。方法:1.使用高效液相色谱法建立人参皂苷Rg3的体外分析方法,考察分析方法的精密度、回收率和稳定性。2.筛选了纳米脂质载体破乳的方法,比较低速离心法、超速离心法、鱼精蛋白沉淀法和透析法四种测定纳米脂质载体包封率的方法。使用高剪切与湿性搅拌介质研磨法(wet stirred media milling,WSMM)结合的工艺,以粒径、包封率和载药量为指标,通过单因素实验和响应面试验,筛选人参皂苷Rg3纳米脂质载体的最佳制备处方和工艺。3.使用带正电荷的乳铁蛋白和带负电荷的纳米脂质载体进行静电结合,以结合后纳米脂质载体的粒径、Zeta电位、PDI、包封率和载药量为指标,筛选了乳铁蛋白和纳米脂质载体结合的最适孵育时间和最适浓度。并考察了乳铁蛋白修饰的人参皂苷Rg3纳米脂质载体的外观、类型、p H值、包封率、载药量、粒径、电位、稳定性和体外释放度。4.采用高效液相色谱法建立人参皂苷Rg3的体内分析方法。对大鼠进行药动学实验,实验将大鼠分为4组,实验组分别经鼻腔给予乳铁蛋白修饰的人参皂苷Rg3纳米脂质载体(Lf-Rg3-NLC)和人参皂苷Rg3纳米脂质载体(Rg3-NLC),对照组分别经鼻腔给予人参皂苷Rg3与空白纳米脂质载体混合液(Rg3-空白NLC)和灌胃给予参一胶囊溶液,测定给药后人参皂苷Rg3在血清和脑组织中各时间点的浓度,计算各组血清和脑组织中的药动学参数,对数据进行方差分析,以靶向指数(DTI)评价各组人参皂苷Rg3的脑靶向性。结果:1.建立了人参皂苷Rg3体外高效液相色谱分析方法,以乙腈-水(45:55,v/v)为流动相,标准曲线方程为Y=3817.3x+3639.4,R=0.9996,精密度、稳定性和加样回收率的RSD值均小于3%。2.选择乙醇为纳米脂质载体的破乳剂,选用低速离心法测定纳米脂质载体的包封率。经单因素实验筛选和响应面实验设计得到纳米脂质载体的最佳制备工艺为:硬脂酸和单油酸甘油酯的质量比为0.21,投入质量占混合脂质0.0625的人参皂苷Rg3,将药物和混合脂质于76℃熔融,注入同温度浓度为1%的吐温-80溶液中,使用高剪切分散乳化机乳化2 min,初乳加入同体积的氧化锆珠,在76℃下1500 rpm研磨4 h,放入4℃冰箱低温固化。该处方制得的人参皂苷Rg3纳米脂质载体的粒径为(162.60±3.72)nm,包封率为(91.56±0.56)%,载药量为(6.67±0.04)%。3.乳铁蛋白和纳米脂质载体通过静电结合的最适孵育时间为6 h,最适浓度为160 mg·m L,制得的乳铁蛋白修饰的人参皂苷Rg3纳米脂质载体粒径为(169.90±6.07)nm,PDI为0.21±0.01,Zeta电位为(5.68±0.33)m V,包封率为(83.39±1.33)%,载药量为(3.41±0.17)%。4.使用高效液相建立了人参皂苷Rg3的体内分析方法,该方法的专属性、精密度、稳定性和回收率均良好。用PKSolver软件计算出经鼻Lf-Rg3-NLC、经鼻Rg3-NLC、经鼻Rg3-空白NLC和灌胃参一胶囊溶液的药动学参数。药动学实验结果表明,与经鼻Rg3-空白NLC和灌胃参一胶囊溶液相比较,经鼻Rg3-NLC和经鼻Lf-Rg3-NLC到达体循环和脑组织的AUC更大,到达脑组织的药量更多。计算乳铁蛋白修饰前后的纳米脂质载体的脑靶向指数DTI,以经鼻Rg3-空白NLC为对照组,经鼻Lf-Rg3-NLC的DTI是2.11,经鼻Rg3-NLC的DTI是1.19,以灌胃参一

关键词：人参皂苷Rg3 纳米脂质载体乳铁蛋白鼻腔给药药动学

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乳铁蛋白

中国乳品工业 1995年第3期23卷 117-120页

作者：郭本恒程玉倩骆承庠东北农业大学食品系黑龙江省食品工业学校

本文概述了乳铁蛋白的基本性质、分离方法和生物活性．并对其开发利用提出展望。乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，它能调节动物体的多种生理功能和影响铁的代谢，这些生物活性和铁量、盐类、ＰＨ、抗体、介质密切相关；色谱法被认为是生产... 详细信息

本文概述了乳铁蛋白的基本性质、分离方法和生物活性．并对其开发利用提出展望。乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，它能调节动物体的多种生理功能和影响铁的代谢，这些生物活性和铁量、盐类、ＰＨ、抗体、介质密切相关；色谱法被认为是生产高纯乳铁蛋白的有效方法．超滤法可用于食品级乳铁蛋白的分离。

关键词：乳铁蛋白营养乳制品食品添加剂

日粮添加乳铁蛋白对断奶仔猪肠道微生物多样性的影响

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畜牧兽医学报 2023年第7期54卷 2942-2955页

作者：纪鹏张斌张春勇邢笑锟杨佳刘韶娜方碟潘洪彬赵彦光安清聪云南农业大学动物科学技术学院云南省动物营养与饲料重点实验室昆明650201 云南省畜牧兽医科学院昆明650224

旨在研究日粮添加乳铁蛋白对断奶仔猪肠道微生物多样性的影响。试验选用断奶滇太仔猪12头,初始体重为(6.12±0.54)kg,随机分为对照组、杆菌肽组和乳铁蛋白组。对照组饲喂基础日粮;杆菌肽组在基础日粮中添加0.5 g·kg^(-1)杆菌肽预混剂;... 详细信息

旨在研究日粮添加乳铁蛋白对断奶仔猪肠道微生物多样性的影响。试验选用断奶滇太仔猪12头,初始体重为(6.12±0.54)kg,随机分为对照组、杆菌肽组和乳铁蛋白组。对照组饲喂基础日粮;杆菌肽组在基础日粮中添加0.5 g·kg^(-1)杆菌肽预混剂;乳铁蛋白组在基础日粮中添加150 mg·kg^(-1)乳铁蛋白,试验期28 d。采集试验第7、21、28天仔猪粪便,通过细菌16S rRNA基因高通量测序检测粪便微生物多样性。结果表明,各组断奶仔猪肠道微生物多样性没有显著差异(P>0.05)。在门水平上,第7、21、28天肠道优势菌为厚壁菌门和拟杆菌门,试验第7天时,各组间厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,乳铁蛋白组厚壁菌门相对丰度降低1.43%,拟杆菌门相对丰度增加16.4%;试验第21天时,乳铁蛋白组与其余两组相比,厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度无显著差异(P>0.05),但与对照组相比,厚壁菌门相对丰度降低16.4%,拟杆菌门相对丰度增加34.1%。试验第28天时,与对照组相比,乳铁蛋白组厚壁菌门相对丰度显著降低(P0.05)。试验第7天时,与对照组相比,乳铁蛋白组乳杆菌属相对丰度降低了50.21%;试验第21天时,与对照组相比,乳杆菌属相对丰度降低了8.42%。试验第28天时,与对照组相比,乳铁蛋白组乳杆菌属相对丰度降低了16.09%。综上所述,本研究发现,日粮中添加乳铁蛋白不会显著影响滇太断奶仔猪的肠道微生物丰富度与多样性,断奶后7、21、28 d仔猪肠道微生物的优势菌门均为厚壁菌门与拟杆菌门,优势菌属为乳杆菌属。

关键词：断奶仔猪乳铁蛋白肠道微生物

乳铁蛋白-EGCG-透明质酸纳米颗粒构建及其递送姜黄素的应用

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乳铁蛋白-EGCG-透明质酸纳米颗粒构建及其递送姜黄素的应用

作者：李雪琪西北农林科技大学

学位级别：硕士

随着现代消费者对食品健康和营养的要求越来越高,生物活性物质受到了前所未有的广泛关注。姜黄素是一种具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤等多种生物功能的活性物质,但其稳定性低、水溶性差、易降解、体内生物利用度低等诸多实际问题阻碍... 详细信息

随着现代消费者对食品健康和营养的要求越来越高,生物活性物质受到了前所未有的广泛关注。姜黄素是一种具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤等多种生物功能的活性物质,但其稳定性低、水溶性差、易降解、体内生物利用度低等诸多实际问题阻碍了其应用。研究表明,设计合理的食品递送载体是解决该问题的有效方法。蛋白质、多酚、多糖等食品生物大分子不仅具有营养价值,还具有强化食品体系的稳定性和功能性的重要作用。酶具有绿色无毒、高效的催化特性,为食品蛋白质改性提供了新思路。此外,不同极性的功能因子共递送具有协同增效的作用。基于此,本文首先优化了酶促交联乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)的制备条件,研究了酶促LF-EGCG共价复合物的制备条件、结构形态和功能属性。进一步地,在酶促LF-EGCG共价复合物的基础上构建LF-EGCG-透明质酸(Hyaluronic acid,HA)三元复合物纳米颗粒,探明了三元复合物纳米颗粒的制备条件、结构特性、稳定性和再分散性。最后,通过模拟体外消化实验和细胞实验证明LF-EGCGHA三元复合物纳米颗粒具有改善姜黄素消化吸收和促进癌细胞凋亡的性质。主要研究内容与结果如下:(1)探究了酶促(漆酶和酪氨酸酶催化氧化)和非酶促(自由基接枝和碱处理)法制备的LF-EGCG共价复合物的最优条件、形成机理和功能性质。研究了EGCG与LF共价结合对LF结构、形态、功能和致敏性的影响。比较了蛋白质、EGCG和酶的加入顺序对酶促共价复合物的影响并优化了酶促反应制备共价复合物的条件。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,酶交联是形成LF-EGCG共价复合物的一种非常有效的方法。圆二色谱等光谱分析表明,与EGCG的结合改变了LF的分子结构。原子力显微镜观察表明,四种共价交联方法影响了LF-EGCG共价复合物的尺寸和形态。与EGCG共价复合后,LF的抗氧化活性和乳化稳定性显著提高。酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验表明,EGCG结合降低了LF对免疫球蛋白E和免疫球蛋白G的结合能力,降低了LF的致敏性。以上结果表明,通过酶促或非酶促法形成的LF-EGCG共价复合物具有潜在的作为食品功能成分的应用前景。(2)探究了食品生物大分子LF-EGCG共价复合物和HA构建的三元复合物纳米颗粒的形成条件及其对姜黄素的包埋和保护效果。在形成LF-EGCG共价复合物(漆酶交联)的基础上,采用pH偏移法制备负载姜黄素的LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒。研究了最终pH、LF-EGCG与HA的质量比和LF-EGCG与姜黄素质量比对形成颗粒的影响。结果表明,最终pH=6、LF-EGCG与HA的质量比为3:1、LF-EGCG与姜黄素质量比为10:1时得到了粒径为144.7 nm,ζ-电位为-24.76 m V,分布均匀且为单分散分布的球形纳米颗粒。在此条件下,姜黄素的包埋率为85.77%,负载率为5.79%。傅里叶变换红外光谱分析表明,LF-EGCG与姜黄素之间存在疏水相互作用和氢键。X射线衍射结果表明纳米颗粒的包埋改变了姜黄素的晶型结构。负载在纳米颗粒中的姜黄素具有良好的高温、紫外光和贮藏稳定性。此外,纳米颗粒良好的再分散性极大地提高了姜黄素在食品工业中的应用价值。(3)探究了负载姜黄素的LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒的体外消化特性、细胞毒性、细胞吸收以及抗癌效果。模拟体外消化实验结果表明,与游离姜黄素(生物可及性22.12%)相比,LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒中姜黄素的生物可及性显著提高至53.55%。Caco-2细胞摄取结果表明,姜黄素纳米颗粒的细胞摄取率为82%。细胞活性实验和细胞凋亡实验结果表明,三元复合物纳米颗粒显著促进了HT-29和CT-26的细胞凋亡,且姜黄素和EGCG在促进HT-29细胞凋亡方面可能具有协同效应。综上所述,通过与EGCG酶促交联,LF的功能特性得到显著改善。在酶促交联LFEGCG的基础上,通过pH偏移法成功制备负载姜黄素的LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒。负载在纳米颗粒中的姜黄素具有良好的光、热、储藏稳定性。LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒具有良好的再分散性。此外,LF-EGCG-HA三元复合物纳米颗粒提高了姜黄素的生物可及性和细胞吸收率,同时促进了癌细胞凋亡。该研究为设计具有协同功效的蛋白质基颗粒作为食品和生物医学领域的递送载体提供了理论基础和技术参考。

关键词：乳铁蛋白漆酶纳米颗粒姜黄素递送

乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体经鼻药动学研究

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乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体经鼻药动学研究

作者：王静仪吉林大学

学位级别：硕士

石杉碱甲(huperzine A,Hup A)为生物活性较强、可逆的乙酰胆碱脂酶抑制剂,无胆碱能毒性,用于改善认知障碍患者的认知功能。目前上市剂型有片剂、胶囊和注射液。石杉碱甲口服制剂具有胃肠道不良反应,且对于具有吞咽和记忆障碍的患者来说... 详细信息

石杉碱甲(huperzine A,Hup A)为生物活性较强、可逆的乙酰胆碱脂酶抑制剂,无胆碱能毒性,用于改善认知障碍患者的认知功能。目前上市剂型有片剂、胶囊和注射液。石杉碱甲口服制剂具有胃肠道不良反应,且对于具有吞咽和记忆障碍的患者来说无法自主用药,而注射液则使用不便,需要医护监护。经鼻给药是脑靶向给药的一种途径,可以从嗅神经和嗅黏膜上皮绕过血脑屏障进入脑组织,但仅以溶液形式经鼻给药时,溶液剂难以进入中鼻道,大部分在鼻腔的后部沉积,同时易被鼻纤毛清除,存在生物利用度低的问题。将药物包载到脂质体中可以避免药物和鼻粘膜的接触,降低对鼻粘膜的刺激性,增强药物的稳定性,减慢其释放速率,达到缓释的目的。为了使脂质体具有主动靶向性,使用可以和脑细胞表面受体结合的乳铁蛋白(Lactoferrin,Lf)进行修饰,脂质体和乳铁蛋白结合后带有正电荷可以与带负电荷的鼻黏膜更好的接触,但脂质体以液体的形式经鼻给药,可能存在流失的问题,温敏凝胶(Thermosensitive Gel)具有较强的粘附行为,能够在生理环境下由液体形式变为不流动的半固体形式,可以防止液体药物的流失。因此再将乳铁蛋白修饰的脂质体制备成脂质体温敏凝胶,将制备的脂质体制剂经鼻给予大鼠体内,并腹腔注射给予大鼠石杉碱甲溶液(Huperzine A Solution,Hup A-Sol),经鼻给予石杉碱甲溶液,灌胃给予石杉碱甲溶液为对照组进行大鼠体内药动学和脑靶向分析。目的:本课题拟制备乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体(Lactoferrin Modified Huperzine A Liposomes,Lf-Hup A-Lips),通过乳铁蛋白的介导,达到将药物靶向输送至脑的目的。方法:1.使用高效液相色谱-紫外检测法建立石杉碱甲的体外分析方法,考察分析方法的精密度、回收率和稳定性。2.筛选了脂质体破乳的方法。比较了葡聚糖凝胶柱层析法,透析法两种测定脂质体包封率的方法。以包封率、载药量和粒径为指标,考察石杉碱甲脂质体的制备工艺,以单因素实验和响应面实验,筛选了脂质体制备的最佳工艺,以脂质体所带负电荷和乳铁蛋白所带正电荷进行静电结合,以结合后脂质体的粒径、电位和多分散系数为指标,筛选了乳铁蛋白和脂质体结合的最适浓度。并考察了乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体的包封率、载药量、p H值、粒径、电位、稳定性和体外释放度。3.通过冷溶法,以胶凝温度为指标制备了乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体温敏凝胶,并对温敏凝胶的外观、p H值和体外释放度进行了考察。4.以高效液相色谱-紫外检测法建立石杉碱甲的体内分析方法,对大鼠进行药动学实验,将大鼠分组,分别腹腔注射给予市售石杉碱甲溶液(Hup A-Sol)、灌胃给予石杉碱甲溶液(Hup A-Sol),经鼻给予石杉碱甲溶液(Hup A-Sol)、经鼻给予石杉碱甲脂质体(Hup A-Lips)、经鼻给予乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体(Lf-Hup A-Lips)和经鼻给予乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体温敏凝胶(Lf-Hup A-Lips-Gel),均在0.03 h、0.08h、0.25 h、0.5 h、1h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h和48 h后,将大鼠摘眼球取血,解剖取脑组织,用乙腈作为蛋白沉淀剂,并用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液碱化,用乙酸乙酯作为萃取剂对血清和脑组织进行处理,将处理后的样品用流动相复溶,用高效液相色谱测定药物在血清和脑组织中各个时间点的浓度,用PKSolver药动学软件计算各制剂在血清和脑组织中的药动学参数,以Spass软件对数据进行方差分析,以脑靶向指数评价给药制剂的脑靶向性。结果:1.建立了石杉碱甲体外高效液相色谱-紫外分析方法,该方法的线性、精密度和稳定性均良好,可用于石杉碱甲的体外分析。2.选择曲拉通水溶液为脂质体的破乳剂。通过两种包封率方法的比较,选用透析法作为测定脂质体包封率的方法,透析平衡时间为8 h,游离药物的加样回收率均大于95%,经单因素和响应面实验设计得到脂质体的最佳制备工艺为蛋黄卵磷脂120 mg,胆固醇13 mg,用3 m L乙醇溶解磷脂膜材,将溶解后的有机相用注射器缓缓注入0.3 mo L·L的硫酸铵水溶液中,置50℃水浴中磁力加热搅拌90 min挥尽乙醇,冰水浴超声30 min,用0.22μm的微孔滤膜过滤,取空白脂质体在12 h内透析,每隔3 h换一次透析液,取透析后的空白脂质体,加入石杉碱甲药物粉末4 mg,43℃水浴中磁力搅拌孵育15 min。乳铁蛋白和脂质体通过静电结合的最适浓度为75 mg·m L。3.当加入16%的泊洛沙姆407和4%的泊洛沙姆188时,乳铁蛋白修饰的石杉碱甲脂质体温敏凝胶的相变温度为35.80±0.40°C。4.建立了石杉碱甲的体内高效液相色谱-紫外检测法,该方法的专属性、精密度、稳定性和回收率均良好。用PKSolver软件计算出腹腔注射Hup A-Sol、

关键词：石杉碱甲脂质体乳铁蛋白鼻腔给药药动学

pH对乳糖-乳铁蛋白复合物结构及理化特性的影响

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现代食品科技 2022年第5期38卷 64-70,217页

作者：黄利华陈帅张业辉张友胜江如蓝钟伟锐焦文娟赵甜甜广州城市职业学院食品科学与美食养生学院广东广州510405 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所农业农村部功能食品重点实验室广东省农产品加工重点实验室广东广州510610 加州大学戴维斯分校营养系美国加州95616 汕尾市五丰海洋生物技术有限公司广东汕尾516626

为了探究热处理条件下不同pH对乳铁蛋白(LF)-乳糖复合物的结构与理化特性的作用,对LF-乳糖复合物的浊度、粒径、微观结构和构象进行测定。结果表明:在不同pH(2~10)条件下,LF-乳糖以不同的结构存在。在pH为2和4的酸性环境中,LF和乳糖处... 详细信息

为了探究热处理条件下不同pH对乳铁蛋白(LF)-乳糖复合物的结构与理化特性的作用,对LF-乳糖复合物的浊度、粒径、微观结构和构象进行测定。结果表明:在不同pH(2~10)条件下,LF-乳糖以不同的结构存在。在pH为2和4的酸性环境中,LF和乳糖处于共溶状态,热处理前后溶液浊度没有明显变化,其粒径维持在10 nm左右。在弱酸性和碱性环境中(6~10),LF和乳糖形成复合物,其溶液浊度明显增大,其粒径也从约10 nm增加到约460 nm。扫描电镜(SEM)显示了其结构从零散分布到线性聚集,再到团状聚集的过程。红外光谱(FT-IR)显示了复合物形成后的酰胺带和890 cm^(-1)处β-糖苷键的特征峰的变化。圆二色谱(CD)显示α-螺旋随pH增加从20.62%减少到18.23%,β-折叠则逐渐从33.35%增加到37.17%。SDS-PAGE图谱表明,碱性条件下生成了以非二硫键为主要作用力的聚集体。研究结果拓展了乳铁蛋白在食品中的应用。

关键词：乳糖乳铁蛋白微观结构构象

乳铁蛋白/硅酸镁锂可注射水凝胶的制备及促进伤口愈合的研究

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乳铁蛋白/硅酸镁锂可注射水凝胶的制备及促进伤口愈合的研究

作者：王琲兰州大学

学位级别：硕士

目的:为解决目前新型伤口敷料普遍存在的制备方法复杂、抗菌性能差等问题,基于乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)良好的抗菌性和抗炎性及硅酸镁锂凝胶(Lithium magnesium silicate hydrogel,LMSH)的剪切变稀性能,采用简易方法制备具有良好抗菌... 详细信息

目的:为解决目前新型伤口敷料普遍存在的制备方法复杂、抗菌性能差等问题,基于乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)良好的抗菌性和抗炎性及硅酸镁锂凝胶(Lithium magnesium silicate hydrogel,LMSH)的剪切变稀性能,采用简易方法制备具有良好抗菌性能和抗炎性能的可注射水凝胶,以改善伤口的愈合状况,为伤口敷料的设计和研发提供新思路。方法:(1)乳铁蛋白/硅酸镁锂水凝胶(LF/LMSH)的制备:将LF(20 wt.%)与LMSH(0.3 wt.%)按照不同体积混匀(1:1,2:1,1:2),分别命名为LF/LMSH(1:1)、LF/LMSH(2:1)和LF/LMSH(1:2)。通过两者间正负电荷的相互吸引作用,形成水凝胶。利用扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FT-IR)等对其形貌、结构进行表征,利用流变学测试对LF/LMSH水凝胶的剪切变稀行为进行验证。(2)LF/LMSH体外抗菌性能及生物相容性测试:通过测定抑菌率,研究不同组别LF/LMSH对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能;采用MTT反应比色法和Calcein-AM/PI双染法,研究其对L929细胞的毒性影响。(3)LF/LMSH伤口愈合效果研究:以未经治疗的大鼠伤口为对照组,以LF、LMSH、LF/LMSH(1:1)、LF/LMSH(2:1)和LF/LMSH(1:2)为实验组,在伤口表面注射水凝胶,于0、4、7和14天分别进行观察并拍照,同时采用H&E染色,Masson染色、CD31及炎症因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)的免疫荧光染色评估伤口的愈合情况。结果:(1)成功制备出可注射水凝胶,SEM结果显示,LF/LMSH(1:2)组表面呈现多孔的网络结构,FT-IR结果也进一步证实了两种材料的成功复合。流变学结果表明,LF/LMSH(1:2)组水凝胶具有显著的剪切变稀性能,满足水凝胶的可注射要求。(2)体内抗菌实验结果表明,LF/LMSH对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的抗菌性能。MTT实验结果表明,在1,2和4 d时各组别L929细胞的存活率均超过90%,表明所制备的LF/LMSH对L929细胞具有良好的生物相容性。而活/死细胞染色结果显示,在培养周期内,对照组和实验组细胞逐渐增加,基本没有死细胞出现,进一步证实了MTT实验的结论。(3)对大鼠创面愈合的大体观察表明,与阳性对照组和阴性对照组相比,LF/LMSH(1:1)组、LF/LMSH(2:1)组和LF/LMSH(1:2)组均有效促进愈合,其中,LF/LMSH(1:2)组水凝胶愈合效果最好,在14 d时创面几乎完全闭合,愈合率达99.1%。组织的镜下观察也表明,LF/LMSH(1:2)组水凝胶具有良好的抗炎能力,可以有效促进胶原沉积和血管生成,从而加速伤口愈合。结论:制备出的LF/LMSH可注射水凝胶,具有良好的剪切变稀性能、抗菌性能、抗炎性能和生物相容性。在大鼠全层皮肤创伤模型中,LF/LMSH(1:2)组水凝胶因其具有促胶原形成能力、促血管生成能力及良好的抗炎作用,能有效促进伤口愈合,14 d愈合率达99.1%,具有作为伤口敷料的应用潜力。

关键词：伤口敷料可注射水凝胶乳铁蛋白剪切变稀抗菌性能

乳铁蛋白对放射性肠损伤的防护作用及机制研究

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乳铁蛋白对放射性肠损伤的防护作用及机制研究

作者：郭雅馨苏州大学

学位级别：硕士

放射性肠损伤是腹部或盆腔肿瘤患者放疗后的常见并发症之一。它主要表现为恶心呕吐、腹痛腹泻、里急后重、肠梗阻、肠穿孔等,严重时可致患者死亡。研究发现,在放射性肠损伤的发病过程中涉及铁死亡,照射可以通过产生大量活性氧,并上调关... 详细信息

放射性肠损伤是腹部或盆腔肿瘤患者放疗后的常见并发症之一。它主要表现为恶心呕吐、腹痛腹泻、里急后重、肠梗阻、肠穿孔等,严重时可致患者死亡。研究发现,在放射性肠损伤的发病过程中涉及铁死亡,照射可以通过产生大量活性氧,并上调关键酶酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的表达,一起促进脂质过氧化,最终导致铁死亡。此外,研究表明,肠道菌群在放射性肠损伤中也发挥重要作用。乳铁蛋白(Lf)是牛奶和其他各种外分泌物中最重要的生物活性物质之一,是一种非血红素铁结合性糖蛋白,在调节铁吸收和免疫反应中发挥重要作用,具有抗炎、抗氧化等多种生物活性,近年来的研究发现Lf可以改善放射性肠损伤,但潜在机制尚不清楚。目的:探究Lf对放射性肠损伤的防护作用及其在凋亡、铁死亡、肠道菌群方面的作用机制。方法:小鼠随机分为对照组(Control)、照射组(10Gy)及乳铁蛋白联合照射组(Lf+10Gy)。于照射前7天,Lf+10Gy组给予250mg/kg Lf灌胃,每天1次。10Gy组和Lf+10Gy组小鼠接受10Gy的腹部照射(WAI)。照射后3.5天处死小鼠,收集血液、肝脏、小肠等样本。测定外周血细胞、肝脏的抗氧化指标、血清的炎症因子水平。通过HE染色及免疫组化对小肠的组织损伤进行评估。采用TUNEL、电镜、Western Blot等方法对小鼠肠组织凋亡和铁死亡情况进行分析,16SrDNA测定肠道菌群。结果:1.受照小鼠体重持续减轻,肠组织、免疫器官和造血系统受损,并且引起炎症反应和氧化应激。2.一般生命体征:与10Gy组相比,Lf+10Gy组小鼠的体重下降和肠道受损情况得到缓解,其脾脏系数、胸腺系数、肝脏系数也有所回升。3.造血系统:与10Gy组相比,Lf+10Gy组的白细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数有所回升。4.抗氧化指标和炎症指标:与10Gy组相比,Lf+10Gy组还原型谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)水平显著回升。白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量有所下降。5.肠组织结构和功能:与10Gy组相比,Lf+10Gy组的绒毛长度显著恢复,杯状细胞数目有所回升,Lgr5和Ki67阳性细胞数显著增加。6.肠组织凋亡水平:照射引起了小肠组织的凋亡。与10Gy组相比,Lf+10Gy组在每个隐窝中的TUNEL阳性细胞数显著下降,抗凋亡B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)的表达显著上升,促凋亡BCL2关联X蛋白(Bax)表达显著下降。7.肠组织铁死亡水平:照射引起了小肠组织的铁死亡。与10Gy组相比,Lf+10Gy组线粒体形态明显改善;在铁代谢途径上,Lf显著下调小肠二价金属转运蛋白(DMT1)蛋白的表达及Fe2+含量;在GSH/GPX4-脂质过氧化途径上,Lf显著上调小肠溶质载体家族7成员(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的蛋白表达,下调ACSL4蛋白表达并降低丙二醛(MDA)水平。8.肠道菌群:照射引起肠道菌群紊乱。与10Gy组相比,Lf+10Gy组显著增加了α多样性的Shannon指数、ACE指数及Chaol指数。与10Gy组相比,Lf+10Gy组 Anaerofustis、Dehalobacterium、Ruminococcus、Bacteroides、Oscillospira 等菌显著增多,Prevotella等菌等显著减少。结论:1.乳铁蛋白可改善抗氧化能力,缓解照射所致的肠损伤,增加受照小鼠小肠细胞的增殖再生能力;2.乳铁蛋白可能通过抑制凋亡和铁死亡改善放射性肠损伤;3.乳铁蛋白改善照射引起的肠道菌群的紊乱,从而改善放射性肠损伤。

关键词：乳铁蛋白放射性肠损伤凋亡铁死亡肠道菌群

乳铁蛋白对高脂喂养诱导的大鼠非酒精性脂肪肝的影响及其机制研究

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乳铁蛋白对高脂喂养诱导的大鼠非酒精性脂肪肝的影响及其机制研究

作者：吴昀宣苏州大学

学位级别：硕士

胆固醇是生命活动中不可或缺的物质。但是,胆固醇水平过高或脂代谢异常会引起动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病,也是肥胖的重要特征之一。乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是一种主要存在于乳汁,也存在于唾液等分泌液中的糖蛋白,属于转铁蛋白家族。L... 详细信息

胆固醇是生命活动中不可或缺的物质。但是,胆固醇水平过高或脂代谢异常会引起动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病,也是肥胖的重要特征之一。乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是一种主要存在于乳汁,也存在于唾液等分泌液中的糖蛋白,属于转铁蛋白家族。LF在调控脂肪细胞发育代谢中发挥重要的作用,近年来动物实验发现LF可以降低高脂饮食喂养的动物体重和血脂/肝脂水平。目的:探讨LF对高脂喂养诱导的大鼠肝脏脂肪变性的改善作用,并从胆汁酸代谢的角度探讨其可能的作用机制。方法:30只5-6周龄雄性SD大鼠,适应性喂养1周后,随机分为三组:脂肪供能比9.4%的纯化饲料喂养的对照组(CON组)、脂肪供能比60%的高脂饲料喂养的高脂组(HFD组)和高脂饲料联合LF干预组(HFD+LF组,将HFD中0.4%酪蛋白替换成LF)。期间每周记录体重和摄食量,在第14和15周时做糖耐量试验(Glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test,ITT)。干预16周后处死动物,取血清、肝脏、肠和肠内容物。检测血清和肝脏中脂代谢相关指标,qPCR法和Western Blot法检测肝脏和小肠中胆固醇代谢和胆汁酸代谢相关基因和蛋白的表达,高效液相色谱-质谱法测定胆汁酸组成,16SrDNA测定肠道菌群。结果:1.体重及脏器重量:HFD组与HFD+LF组的能量摄取显著高于CON组,但HFD组与HFD+LF组间无显著性差异。实验结束时,HFD+LF组大鼠的平均体重、肝脏重量、附睾脂肪重量、肾周脂肪重量及内脏脂肪总重量均显著低于HFD组。因此,LF干预降低了高脂引起的体重和体脂的增重。2.血液学指标:HFD组血清甘油三酯(Triglyceride,TG)水平显著高于CON组,HFD+LF组血液中TG则显著低于HFD组。另外,HFD组中谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)与谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)水平显著高于CON组,LF干预显著降低血清AST水平。因此,LF能在一定程度上缓解高脂引起的肝损伤。3.糖代谢:HFD组的空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment insulin resistance,HOMA-IR)以及胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test,ITT)和葡萄糖耐量试验(Glucose tolerance test,GTT)的血糖曲线下面积(Area under the curve,AUC)显著高于CON组。与HFD组比较,HFD+LF组的FBG、HOMA-IR及ITT的葡萄糖AUC显著降低。LF干预改善了糖耐量异常,增加了胰岛素敏感性。4.肝脏组织病理学:肝脏HE切片下,HFD组可见大量大小不均的脂滴空泡堆积、大泡性脂肪变性和微泡状脂肪变性。LF干预后,肝脏脂肪变性有所改善。半定量分析发现,HFD+LF组的Steatosis和非酒精性脂肪肝活动度评分(Non-alcoholic fatty liver disease activity score,NAS)均显著低于 HFD 组。另外,HFD组肝脏中TC和TG含量显著升高,LF干预则显著降低其含量。因此,LF减轻肝脏脂滴的积累,改善肝脏脂肪变性。5.肝脏氧化应激:与对照组比较,HFD组肝脏中总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)及过氧化氢酶(Catalase,CAT)显著降低,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)显著升高,LF干预则显著升高了 T-AOC与CAT,降低MDA水平。因此,LF改善该高脂诱导的氧化应激。6.胆固醇代谢:与CON组比较,高脂喂养影响了正常的胆固醇代谢。与HFD组相比,LF显著上调肝脏和肠道胆固醇外流相关的ATP结合盒亚家族A成员 1(ATP binding cassette subfamily A member 1,ABCA1)和 ATP 结合盒亚家族G 成员 5(ATP binding cassette subfamily G member 5,ABCG5)基因和蛋白的表达,同样也显著上调肠道ATP结合盒亚家族G成员1(ATP binding cassette subfamily G member 1,ABCG1)的基因表达。对肠道胆固醇吸收及合成相关蛋白清道夫受体 B 类成员 1(scavenger receptor class B member 1,SR-BI)和 NPC1-like intracellular cholesterol transporter 1(NPC1L1)的表达则无显著性的影响。7.胆汁

关键词：乳铁蛋白胆固醇胆汁酸非酒精性脂肪肝脂代谢