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中国葡萄属野生种芪合成酶基因载体构建及转化烟草研究

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中国葡萄属野生种芪合成酶基因载体构建及转化烟草研究

作者：徐伟荣西北农林科技大学

学位级别：硕士

白藜芦醇作为葡萄属植物的抗逆代谢物质-植保素（phytoalexin）,是葡萄属植物对病原菌或其它各种诱发因子胁迫下迅速在细胞中累积的一种次生代谢物质,它在细胞中的积累可以提高植物的抗病性。本研究是在获得中国葡萄属野生种华东葡萄白... 详细信息

白藜芦醇作为葡萄属植物的抗逆代谢物质-植保素（phytoalexin）,是葡萄属植物对病原菌或其它各种诱发因子胁迫下迅速在细胞中累积的一种次生代谢物质,它在细胞中的积累可以提高植物的抗病性。本研究是在获得中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1芪合成酶基因（STS）的基础上构建中国葡萄属野生种芪合成酶基因植物表达载体,并将其转入根癌农杆菌GV3101 中,然后通过农杆菌介导法将STS 基因导入烟草,借以初步探讨芪合成酶基因在烟草中的转化和表达情况,为其今后在葡萄属植物上的应用提供依据。主要研究结果如下:　 1.　中国葡萄属野生种芪合成酶基因的克隆、序列测定　根据本课题组获得的中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1 芪合成基因cDNA 全长序列,设计特异引物,并进行了修饰和改造,即增加了与植物表达载体pWR306 相匹配的限制性内切酶酶切位点。通过PCR 扩增出目的片段,回收目标产物,克隆到pGEM-Teasy 载体中,得到重组质粒pGEM-T-STS,转化大肠肝菌DH5a,小量提取质粒进行酶切验证。经序列测定,该目的片段为1179bp,与本课题组克隆的芪合成酶基因cDNA 全长序列一致。　 2.　植物中间表达载体的构建及鉴定　利用DNA 重组技术,将质粒pSB166 中包含ED35s-O-MCS-UTT-TNOS 的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303 上,经酶切、电泳鉴定表明,已成功构建了植物中间表达载体pWR306。　 3.　中国葡萄属野生种芪合成酶基因植物表达载体的构建　双酶切重组质粒pGEM-T-STS 及表达载体pWR306,将STS 基因片段与线性表达载体pWR306 进行定向连接,构建了芪合成酶基因的植物表达载体pWR-STS,通过酶切、电泳鉴定,STS 基因已成功构建到植物表达质粒pWR306 中,将此克隆命名为pWR-STS。　 4.　重组质粒pWR-STS 导入根癌农杆菌GV3101　采用改进冻融法,将重组质粒pWR-STS 导入农杆菌GV3101 中,在卡那霉素和庆大霉素的平板上筛选阳性克隆,至有单菌落出现,进行菌落直接PCR 和提取质粒、PCR 扩增检测,结果表明重组质粒已导入农杆菌GV3101 中。　 5.　烟草遗传转化及检测　通过对影响农杆菌介导烟草遗传转化的几个主要因素的探讨,确定了各主要影响因素的值:即取烟草叶片在分化培养基上预培养2天,农杆菌侵染适宜浓度为0.5（OD600）,侵染时间6min,在含100　μM 乙酰丁香酮（Acetosyringone,AS）的共培养培养基中暗培养　2天,可以明显提高烟草的转化率。确定了潮霉素选择压力为25mg/L时,可有效地抑制非

关键词：中国葡萄属野生种芪合成酶基因植物表达载体烟草遗传转化

中国葡萄属野生种抗寒性鉴定与抗寒基因的RAPD标记

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中国葡萄属野生种抗寒性鉴定与抗寒基因的RAPD标记

作者：张文娥西北农林科技大学

学位级别：硕士

本研究以中国葡萄属野生种10 个种38 个株系、河岸葡萄2 个株系、5 个欧洲葡萄品种、1 个欧美杂种以及2 个种间杂交组合51 株后代和2 个自交组合54 株后代共151份材料为试材,利用电导法、生长法和离体枝条含水量的动态变化三项生理指标... 详细信息

本研究以中国葡萄属野生种10 个种38 个株系、河岸葡萄2 个株系、5 个欧洲葡萄品种、1 个欧美杂种以及2 个种间杂交组合51 株后代和2 个自交组合54 株后代共151份材料为试材,利用电导法、生长法和离体枝条含水量的动态变化三项生理指标进行了抗寒性鉴定,然后用隶属函数法对上述材料进行了抗寒性综合评价;同时进行了葡萄属（Vitis）植物抗寒基因RAPD 标记的研究。主要取得了以下研究结果:　 1.供试材料中的山葡萄和河岸葡萄平均隶属度在0.7以上,属于抗寒性极强的类型;燕山葡萄、蘡薁葡萄和复叶葡萄平均隶属度介于0.5-0.7 之间,属于抗寒性强的类型;毛葡萄、秋葡萄、刺葡萄、瘤枝葡萄、麦黄葡萄、秦岭葡萄的平均隶属度介于0.4-0.5之间,抗寒性较弱;欧洲葡萄的平均隶属度小于0.4,抗寒性极差。　欧山杂种北醇和欧美杂种巨峰平均隶属度分别为0.572 和0.541,属于抗寒性较强的品种。　玫瑰香×黑龙江实生、红地球×北醇两个组合杂交后代的抗寒性表现基本介于双亲之间,个别出现超亲遗传现象;红地球自交后代（平均隶属度为0.005～0.505）和北醇自交后代（平均隶属度为0.360～0.747）的抗寒性表现也出现分离。　 2.以红地球×北醇F1代分离群体为试材,获得了1 个与中国葡萄属野生种抗寒基因相连锁的RAPD 标记S241-691,并将该标记在玫瑰香×黑龙江实生、红地球×红地球、北醇×北醇杂交后代及中国葡萄属野生种、欧洲葡萄品种、河岸葡萄、欧美葡萄杂种中进一步验证表明:S241-691 为多数抗寒性较强的葡萄属植物所共有的抗寒基因标记,具有一定的普遍性,这也充分说明与中国葡萄属野生种抗寒基因相连锁的RAPD 标记在葡萄属植物中具有一定的通用性。　 3.将葡萄抗寒基因RAPD 标记S241-691 回收、克隆,并测序,获得了该标记的核苷酸序列,由691bp 特定碱基组成。这为进一步将RAPD 标记转化为专一性更强的SCAR 标记或制备抗寒基因分子探针及利用染色体步移法克隆葡萄抗寒基因谱奠定了基础。　 4.用Wingene231　DNA 分析软件对S241-691 序列的限制性内切酶位点进行了分析,有52个可识别6个碱基及其以上序列酶切位点的限制性内切酶在S241-691序列上存在酶切位点,EcoRⅠ在S241-691 上没有酶切位点,HindⅢ在第357 和521 个碱基处存在酶切位点。　 5.在GenBank 中,对S241-691 的DNA 序列进行了BLAST 相似性分析和开放阅读框架（ORF）分析。该序列与GenBank 中其它生物的DNA 序列同源性较小,为葡萄属（Vitis）植物基因组所特有。

关键词：中国葡萄属野生种抗寒性抗寒基因 RAPD 标记

中国葡萄属野生种抗白粉病相关基因克隆及生物信息学分析

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中国葡萄属野生种抗白粉病相关基因克隆及生物信息学分析

作者：杨进孝西北农林科技大学

学位级别：硕士

本研究通过两年的田间和试验室工作，围绕葡萄优质抗病育种的中心目标，以中国葡萄属野生种白藜芦醇高产株系商南－24、抗白粉病株系白河-35-1 和欧洲葡萄感炭疽病品种凤凰－51 为主要材料，利用 RT-PCR 技术就白藜芦醇次生代谢过程... 详细信息

本研究通过两年的田间和试验室工作，围绕葡萄优质抗病育种的中心目标，以中国葡萄属野生种白藜芦醇高产株系商南－24、抗白粉病株系白河-35-1 和欧洲葡萄感炭疽病品种凤凰－51 为主要材料，利用 RT-PCR 技术就白藜芦醇次生代谢过程调控和抗病基因克隆新策略研究方面作了一些尝试性的探索，主要取得以下几个方面的研究结果： 1.通过抗病基因克隆新策略和定量－简并 PCR 技术，得到与中国葡萄属野生种抗白粉病株系白河-35-1 抗病可能有密切关系的基因片段三条：9－2、7＃、15＃,它们的大小分别为 200bp、565bp、211bp。这几个基因片段的序列在 GeneBank 的登录号为分别为：AY656730、 AY656725、 AY656731。9－2 基因片段与从欧洲葡萄逆境胁迫的 cDNA 文库中的多条 EST 序列同源;进一步分析表明该基因片段可能是葡萄抗病和次生代谢过程中涉及基因调控的某一反式作用因子的编码基因的一部分，在反式作用因子与葡萄抗病过程中信号的识别、传递、放大或防卫基因的转录都可能有关。7＃基因片段与欧洲葡萄受逆境胁迫的 cDNA 文库和多种植物微丝形成期的 cDNA 文库中的多条 EST 序列存在着同源关系，但具体功能未知;定量 PCR 结果表明，该基因片段在白河－35－1 受白粉病侵染时转录量有较大的变化，因此该基因片段可能与植物的纤维性物质合成及相应的葡萄结构性抗病诱导有关。15＃基因片段在生物信息学数据库中未找到任何同源序列，说明该基因片段可能是一条新基因，该基因片段在定量－简并 PCR 中的欧亚种葡萄感白粉病品种佳利酿的 cDNA 扩增结果中表现为低水平的本底表达，但在白河－35-1 中随病原菌入侵增幅明显，这暗示着该基因片段可能是一条首次发现的在葡萄抗病中有特殊意义的新基因。 2.在葡萄PAL 途径抗病相关基因克隆研究方面。通过增加提取缓冲液中PVP的含量、减小样品量与总缓冲液比值，在提高总 RNA 提取纯度的同时提高了相对产率。从中国葡萄属野生种白藜芦醇高产株系商南-24 mRNA 中经 RT-PCR 克隆到与葡萄白藜芦醇合成和葡萄抗病有密切关系的 STS 基因家族的三个成员的 14＃、40－1、41－1 基因片段，它们的大小分别为：772bp、720bp、283bp。这几个基因片段的序列目前已等录 GeneBank，登录号为：AY656724、 AY656725、 AY656726。定量 PCR 同时获得有类似作用的 CHS 基因（果实与叶片中各得到一条）、PPO 基因（叶片中特异表达）的三个基因片断。从商南-24 DNA 中经 PCR 扩增得到具有相同作用的苯丙氨酸裂解酶基因片断一个，它们的大小分别为 460bp、340bp、267bp．这几个基因片段的序列目前也已等录 GeneBank，登录号为：AY656727、 AY656728、 AY656729、AY656733。 3.在葡萄重要植保素物质白藜芦醇高产机制研究方面，从商-24 DNA 中经 PCR 扩增得到两个准 STS 启动子，其中一个上面可能有病原诱导应答元件。将白藜芦醇产生机制的差异细化到不同葡萄株系的不同基因家族成员的转录活性的不同及其单核苷酸位点多态性上。 4. 在抗病基因克隆中，通过定量 PCR 技术研究了受白粉病病原菌侵染不同时间的中国葡萄属野生种抗白粉病株系白河-35-1 中部分本实验中得到的防卫基因的转录活性变化情况，研究了欧亚种葡萄感炭疽病品系凤凰－51 果皮中防卫基因 CHS 转录量与炭疽病侵染面积的关系。在一定程度上验证并丰富了防卫基因与葡萄抗病性的关系的理论，为研究葡萄抗病基因克隆提供了方便新颖的采样思路。，通过对生物信息学分析方法 —Motif 分析的反向思维，运用 PCR 原理建立了定量-简并 PCR 技术体系，并经过了初步验证。 5.建立了确定在本地气候和本试验条件下葡萄抗病基因表达时间的方法，并根据本试验方法确定了中国葡萄属野生种抗白粉病株系白河-35-1 抗白粉病基因的大致表达时间为 5～8ｄ。为有的放矢地克隆葡萄抗病基因提供了可能。

关键词：中国葡萄属野生种抗病基因基因克隆防卫基因白藜芦醇

mRNA差异显示技术克隆中国葡萄属野生种核糖体RNA基因

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西北植物学报 2005年第11期25卷 2163-2167页

作者：张今今王跃进西北农林科技大学园艺学院

克隆功能基因是研究植物基因结构及功能的重要途径.利用mRNA差异显示技术,筛选获得了中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1在人工接种白粉菌前后差异表达基因的cDNA片段V prdrf4.经N orthern杂交验证,该片段为正调控片段,B last检索表明... 详细信息

克隆功能基因是研究植物基因结构及功能的重要途径.利用mRNA差异显示技术,筛选获得了中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1在人工接种白粉菌前后差异表达基因的cDNA片段V prdrf4.经N orthern杂交验证,该片段为正调控片段,B last检索表明与真核生物核糖体RNA基因的同源性高达90%以上,G enB ank登录号为CD 347664.

关键词：核糖体 mRNA基因 mRNA差异显示中国葡萄属野生种

中国华东葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因的原核表达及抗体制备

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中国华东葡萄抗坏血酸过氧化物酶基因的原核表达及抗体制备

作者：林玲西北农林科技大学

学位级别：硕士

葡萄白粉病是危害世界葡萄生产的主要真菌病害,起源于北美洲,目前该病的分布范围已经遍及全世界,而且目前世界上主栽的品质优良的欧洲葡萄品种绝大多数不抗该病,因此,该病对世界的葡萄生产造成了严重的经济损失。我国是葡萄属植物的重... 详细信息

葡萄白粉病是危害世界葡萄生产的主要真菌病害,起源于北美洲,目前该病的分布范围已经遍及全世界,而且目前世界上主栽的品质优良的欧洲葡萄品种绝大多数不抗该病,因此,该病对世界的葡萄生产造成了严重的经济损失。我国是葡萄属植物的重要原产地之一,而且我国的野生葡萄对真菌病害具有较强的抗性。随着现代生物技术的高速发展,利用基因工程手段可将抗病基因直接导入感病品种,从而育成抗病性明显提高而原有的经济性状不发生分离的转基因新品种,克服了传统方法的缺点。在转基因之前,有必要在体外对目的基因的表达特性及功能进行相应的分析,从而为转基因植株的检测、安全性评价奠定基础。本研究的目的旨在体外对葡萄抗白粉病相关基因-抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因进行相应的研究。根据已克隆的中国葡萄属野生种抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因序列设计并合成特异性PCR引物,以华东葡萄白河-35-1的cDNA第一链为模板,通过PCR扩增获得APX基因,并进一步将之克隆在中间载体pGEM-T easy上。用限制性内切核酸酶从中间载体上切下目的基因,将之插入到表达载体pGEX-4T-1上获得重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21并用IPTG进行诱导,得到GST-APX融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的35%,且以可溶和包涵体两种形式存在。可溶性蛋白经GST亲和树脂纯化后可得到高纯度的目的蛋白。融合蛋白作为抗原免疫家兔制备得到多克隆抗体。本实验取得如下研究结果 1成功地将扩增得到的目的基因APX基因与克隆载体pGEM-T easy连接并转化到宿主菌DH5α中,构建了重组克隆载体pGEM-T/APX。 2从克隆载体上切下目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1相连,构建了APX的原核表达载体pGEX-4T-1/APX,根据序列分析表明,目的基因按正确的阅读框架插入到表达载体中。筛选出阳性重组体,用IPTG诱导,表达的蛋白产物通过12% SDS-PAGE分析,证明APX基因在大肠杆菌中成功的得到了表达,表达产物的分子量约为55kDa.

关键词：中国葡萄属野生种抗坏血酸过氧化物酶融合表达多克隆抗体