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作者：任利娜河南科技大学

学位级别：硕士

双生病毒-媒介昆虫-宿主植物三者之间存在着复杂的互作关系。宿主植物在受到植食性昆虫取食或病原物侵染时可诱导其产生不同的防御反应,包括引起植物营养物质的改变、诱导植物防御物质的变化及植株体内活性氧(reactive oxygen species,R... 详细信息

双生病毒-媒介昆虫-宿主植物三者之间存在着复杂的互作关系。宿主植物在受到植食性昆虫取食或病原物侵染时可诱导其产生不同的防御反应,包括引起植物营养物质的改变、诱导植物防御物质的变化及植株体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和积累等。本研究以普通烟Nicotiana tabacum为材料,比较了烟粉虱Bemisia tabaci取食及其与中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)共侵染后普通烟植株中营养物质可溶性糖和可溶性蛋白质含量、防御物质多酚含量及主要氧化酶活性的变化,HO的产生与积累及植株中蛋白组分图谱的变化,探讨了烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染诱导宿主植物普通烟防御反应的差异。主要研究结果如下:(1)TYLCCVN与烟粉虱共侵染对普通烟植株内可溶性糖、可溶性蛋白及多酚含量的影响与对照植株相比,TYLCCNV与烟粉虱共侵染可导致普通烟植株中可溶性糖和可溶性蛋白含量明显降低,多酚含量显著升高。与烟粉虱取食植株相比,TYLCCNV与烟粉虱共侵染后1 d时普通烟植株中可溶糖含量显著降低,降低了21.05%,3、7和9 d时可溶性蛋白含量均显著降低,分别降低了27.40%、26.84%和20.90%;共侵染后的1、3、5和9 d时多酚含量均显著降低,分别降低了34.60%、14.30%、3.07%和15.19%。(2)TYLCCVN与烟粉虱共侵染对普通烟植株内氧化酶酶活性的影响与对照植株相比,TYLCCNV与烟粉虱共侵染可导致普通烟植株中过氧化氢酶酶活性显著升高,超氧化物歧化酶和过氧化物酶酶活性呈现先升后降的峰型变化。与烟粉虱取食植株相比,TYLCCNV与烟粉虱共侵染的1、3、5和7 d时CAT活性分别提高了3.04、1.42、1.68和1.96倍;共侵染后的9 d时SOD活性显著升高,共侵染后7 d时POD活性显著降低。(3)TYLCCVN与烟粉虱共侵染对普通烟植株内HO产生的影响与烟粉虱取食处理相比,TYLCCNV与烟粉虱共侵染后的第1和3 d时,处理植株内HO含量间差异不显著,而处理后的第5、7和9 d时,共侵染处理植株中HO含量分别是烟粉虱取食植株中的1.39、1.69和1.66倍。烟粉虱取食植株或TYLCCNV与烟粉虱共侵染植株内均未检测到HO的聚集。(4)TYLCCNV与烟粉虱共侵染对普通烟植株内蛋白质组分图谱的影响烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染均能诱导普通烟植株内蛋白质组分图谱发生不同程度的变化,其中伴随着某些多肽条带的增加或消失,45-66 k Da之间颜色最深、体积最大的多肽条带的强度在不同处理间差异明显。

关键词：中国番茄黄化曲叶病毒烟粉虱普通烟防御反应

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两种双生病毒伴随的卫星启动子的鉴定

两种双生病毒伴随的卫星启动子的鉴定

作者：张馨月浙江大学

学位级别：硕士

DNAβ是与某些单组份双生病毒相伴随的卫星分子,能在自然寄主上引起典型侵染症状。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都编码一个大小和位置保守的βCl基因,它是一种致病决定因子。关于βCl基因启动子的研究,目前的研究报道还很少。赛... 详细信息

DNAβ是与某些单组份双生病毒相伴随的卫星分子,能在自然寄主上引起典型侵染症状。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都编码一个大小和位置保守的βCl基因,它是一种致病决定因子。关于βCl基因启动子的研究,目前的研究报道还很少。赛葵黄脉病毒(MYVV)和中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)均是本实验室鉴定的伴随有DNAβ分子的单组份双生病毒,为了进一步明确它们伴随的卫星DNA启动子对病毒症状的调节作用,本论文分离并鉴定了TYLCCNV Y25分离物(TYLCCNV-Y25)和MYVV Y47分离物(MYVV-Y47)DNAβ分子上βCl基因的启动子。利用根癌土壤杆菌介导的方法鉴定了MYVV-Y47 DNAβ分子上βCl基因的启动子。用GUS和GFP基因做为报告基因,通过组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性。瞬时表达结果表明,MYVV-Y47βCl基因翻译起始位点上游的991核苷酸(nt)片段具有启动子活性;5'端缺失的片段以及A-rich区缺失的片段均保留了启动子活性;与花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子相比,991 nt片段的启动子活性最高,是35S启动子活性的28.05%。对启动子进行遗传转化后进行组织化学检测表明,翻译起始位点上游的991 nt和214 nt片段均能够驱动GUS基因在转基因普通烟植株中组成型表达。利用根癌土壤杆菌介导的方法鉴定了TYLCCNV-Y25 DNAβ分子上βCl基因的启动子。用GUS基因做为报告基因,通过组织化学法和荧光光度法测定启动子的活性。瞬时表达结果表明,TYLCCNV-Y25βCl基因翻译起始位点上游的982 nt片段具有启动子活性,其活性是CaMV 35S启动子活性的46.23%。5'端以及A-rich区都缺失的206 nt片段保留有启动子活性并且其活性与982 nt片段的启动子活性没有显著性差异。

关键词：赛葵黄脉病毒中国番茄黄化曲叶病毒 βC1基因启动子

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四川攀枝花赛葵上双生病毒的检测与鉴定

四川攀枝花赛葵上双生病毒的检测与鉴定

作者：于云奇西南大学

学位级别：硕士

粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted geminivirus, WTG)是世界上多种经济作物上的重要病原之一,造成的危害和损失严重。近年来在我国海南、广东、福建、云南等地多有WTG侵染的报道,在四川的番茄上也已造成严重的危害。本实验室从四川... 详细信息

粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted geminivirus, WTG)是世界上多种经济作物上的重要病原之一,造成的危害和损失严重。近年来在我国海南、广东、福建、云南等地多有WTG侵染的报道,在四川的番茄上也已造成严重的危害。本实验室从四川攀枝花发现了表现黄脉症状的杂草赛葵样品,由于杂草是双生病毒重要的中间寄主和初始侵染源,为明确杂草赛葵样品中双生病毒的种类,我们对这些赛葵样品进行了针对双生病毒的检测,并对病毒的基因组结构及变异进化进行了分析。利用已报道的双生病毒通用引物PA/PB,对所有155份赛葵样品进行PCR检测,共有108份样品扩增到了长约500bp的特异片段,阳性率为69.68%,其中仁和区的样品64份,红格镇44份,这表明赛葵样品中存在双生病毒的侵染。扩增到了病毒DNA-A的全基因组,序列比对分析表明,赛葵样品中扩增到的双生病毒包括中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)及云南赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus,MYVYNV)两种病毒。通过序列比对及构建系统进化树发现,赛葵样品(SC44、SC95、SC170、SC211、SC314、SC344、SC327及SC329)扩增到的MYVYNV与GenBank中登录的MYVYNV(AJ971501.2)具有最大的序列相似性(98.4%-99.9%),亲缘关系最近;样品SC44扩增到的TYLCCNV-SC44与TYLCCNV-TbY10 (AJ319675)序列相似性高达99.1%,而从样品SC327中扩增到的TYLCCNV-SC327与TYLCCNV-TbSC101 (JN082233.1)的序列同源性高达99.5%。利用双生病毒卫星DNAβ分子的通用引物β01/β02,从89份样品中扩增到了长约1300bp的条带,阳性率为57.42%,其中仁和区的样品有54份,红格镇35份。经鉴定样品中存在两类卫星DNAβ分子,分别是伴随MYVYNV的卫星MYVYNB和伴随MYVV的卫星MYVB。利用双生病毒卫星DNAα分子及DNA-B组份的特异性引物在所有样品中均未检测到目的条带。对赛葵样品中病毒及卫星DNAβ分子复合侵染的检测表明,用双生病毒特异性引物检测这些样品,有104份样品检测到了MYVYNV,有70份检测到了TYLCCNV,同时检测到这两种病毒的样品共有70份,所占比例为45.16%,表明田间赛葵样品中双生病毒复合侵染现象普遍。有19份样品同时检测到两种病毒MYVYNV和TYLCCNV及伴随两种卫星MYVYNB和MYVB,占比例为12.26%,仅有1份样品为两种卫星MYVYNB和MYVB分子共同伴随MYVYNV但未伴随TYLCCNV;未发现MYVYNB和MYVB这两种卫星分子仅仅伴随TYLCCNV的现象。

关键词：四川赛葵中国番茄黄化曲叶病毒云南赛葵黄脉病毒 DNAβ 鉴定

双生病毒卫星DNA编码的βC1基因的原核表达、单克隆抗体制备及细胞定位

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双生病毒卫星DNA编码的βC1基因的原核表达、单克隆抗体制备及细...

作者：姜磊浙江大学

学位级别：硕士

双生病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环状DNA病毒，至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。近年来发现一些单组分双生病毒伴随有卫星DNAβ。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都含有一个位置和大小保守的βC1基因，... 详细信息

双生病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环状DNA病毒，至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。近年来发现一些单组分双生病毒伴随有卫星DNAβ。迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都含有一个位置和大小保守的βC1基因，该基因是一个参与症状诱导的关键因子。本论文进行了βC1基因的原核表达，并制备了单克隆抗体。利用原核表达载体pET-30a和pET-32a在大肠杆菌中分别表达了与中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus)Y10分离物(TYLCCNV-Y10)和烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus)Y35分离物(TbCSV-Y35)相伴随的DNAβ分子的βC1基因，用Ni-NTA树脂亲和纯化了重组蛋白Y10βC1和Y35βC1。分别以重组蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，用杂交瘤细胞技术制备了6株能够稳定传代并分泌抗Y10βC1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各单抗腹水的间接ELISA效价在1：16000～1：128000之间，获得9株分泌抗Y35βC1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各单抗腹水的间接ELISA效价在1：128000～1：1024000之间。用制备的Y10βC1和Y35βC1单克隆抗体分别对TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35侵染的烟草中的βC1蛋白进行亚细胞定位，结果发现该蛋白在健康烟草中没有积累，而在病毒侵染的烟草细胞核和叶绿体中表达并积累。

关键词：中国番茄黄化曲叶病毒烟草曲茎病毒原核表达卫星DNA DNAβ βC1基因单克隆抗体

三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析

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三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析

作者：李晓静云南农业大学

学位级别：硕士

三七是我国中药材中的一颗明珠，具有非常重要的药用和医疗保健价值。但因其特殊的生长、管理条件，很容易造成病毒病的发生，该病害的发生严重影响三七的生活力，降低三七的产量和质量，对生产构成严重的威胁。但到目前为止，有关三七... 详细信息

三七是我国中药材中的一颗明珠，具有非常重要的药用和医疗保健价值。但因其特殊的生长、管理条件，很容易造成病毒病的发生，该病害的发生严重影响三七的生活力，降低三七的产量和质量，对生产构成严重的威胁。但到目前为止，有关三七病毒病的研究很少，而且现有的研究也仅仅停留在三七病毒病原物的鉴定层面上。植物病毒病被称作是“植物的癌症”，防治植物病毒病最重要的工作首先就是要明确病毒病原物，然后才能通过分析各个病原物的传播方式、寄主范围及发生规律等方面防控病毒病的发生。鉴于此，本文旨在通过对三七病毒病病原物开展进一步的鉴定研究，探明三七病毒中除三七Y病毒(Panax virus Y，PnVY)外的其他种类及优势种，明确其寄主范围，确定病毒分离物/复合体与症状类型的相关性，为进一步深入开展相关病毒的致病性分子机理、病害的监测和预报以及有效防控提供坚实的理论基础和技术指导，并对国内外该领域的相关研究工作起到一定的借鉴和推动作用。本文以三七病叶为材料提取dsRNA及提纯病毒，并尝试以dsRNA为模板构建cDNA文库得到可能的病毒种类，以三七病毒提纯产物为材料通过电镜技术和SDS-PAGE、质谱分析技术分别进行病毒粒子形态观察及可能的病毒种类初步鉴定。结果经dsRNA、提纯病毒及电镜技术等再次验证三七病样除了PnVY之外还存在不止一种病毒病原物。而由于提取的dsRNA浓度过低，致使没能成功完成对cDNA文库的构建。质谱分析的结果显示三七病样中可能存在大豆矮缩病毒(Soybean dwarf virus，SbDV)，但经SbDV特异性引物检测及序列分析，并未在该批三七病样中检测到SbDV。应用双生病毒(geminiviruses)的基因组DNA及卫星(betasatellite)的DNA检测通用引物和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV)的特异性引物，在三七病样YWSh03中检测到了的TYLCCNV和TYLCCNB，并获得了TYLCCNV和TYLCCNB的全长基因组序列。然后将含有TYLCCNV及TYLCCNB侵染性克隆的农杆菌菌悬液、菌落接种至三七叶片上，并且通过获毒的粉虱对三七进行传毒试验。结果农杆菌接种的三七苗都表现为黄化症状，而粉虱传毒的三七苗症状不明显，但通过PCR检测均能检测到TYLCCNV和TYLCCB。通过分子生物学和生物学的方法证实了TYLCCNV及TYLCCNB对三七的侵染，完成了柯赫氏法则的验证，这是TYLCCNV及TYLCCNB侵染人参属植物的首次报道。以三七病叶、dsRNA和病毒提纯产物为接种材料，将其摩擦接种于供试植株中，接种一月之久，大部分寄主表现出褪绿黄化的症状，但经RT-PCR检测后，PnVY的寄主只有有茄科的黄烟、辣椒和豆科的豇豆。对文山、红河、昆明、曲靖等地的三七种植园进行了病害调查和相关病毒的检测。发现三七病毒病的症状类型多样，发病率逐年增加，且田间表现复合症状的居多。初步建立了PnVY和TYLCCNV的双重PCR检测体系，该体系能够快速及时准确的对三七田间这两种病毒的发生开展检测及分析。运用双重PCR检测体系对不同地区三七病样的PnVY和TYLCCNV的带毒率进行检测，发现由两种病毒复合侵染的现象较多，复合侵染率在38.7%0.0%之间，且从整体来讲，PnVY对三七的侵染率最高。获得了5个PnVY分离物的全基因组序列、6个TYLCCNV分离物基因组全序列及4个TYLCCNB的基因组全序列，并对其进行基因组结构分析及系统进化分析，推测三七病毒病复杂多样的症状类型可能与TYLCCNV及TYLCCNB无太大相关性，但可能与PnVY的基因组结构相关，尤其是PnVY的P1蛋白可能与三七症状多样性相关。

关键词：三七三七Y病毒中国番茄黄化曲叶病毒中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNAβ 基因组结构

利用酵母双杂交从拟南芥中筛选与TYLCCNV重要致病因子βC1相互作用的蛋白

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利用酵母双杂交从拟南芥中筛选与TYLCCNV重要致病因子βC1相互作...

作者：罗玉梅湖北大学

学位级别：硕士

中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)是双生病毒科,菜豆金色花叶病毒属的一种,给多种农作物造成严重危害。伴随TYLCCNV的β卫星DNA编码的βC1蛋白是致病的关键因子,且参与的植物生理调控途径众多。目前,多数βC1的研究是在TYLCCNV的天然宿主... 详细信息

中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)是双生病毒科,菜豆金色花叶病毒属的一种,给多种农作物造成严重危害。伴随TYLCCNV的β卫星DNA编码的βC1蛋白是致病的关键因子,且参与的植物生理调控途径众多。目前,多数βC1的研究是在TYLCCNV的天然宿主烟草中进行的。异源四倍体烟草的基因组测序和基因组注释的完整程度、敲除突变体等遗传资源相对不足,以其作为模式植物来研究βC1的复杂功能尚有不便之处。因此,本研究拟选择遗传信息与遗传资源最便利的模式植物拟南芥进行βC1复杂功能的深入研究。拟南芥虽不属于TYLCCNV的宿主范围,不能被TYLCCNV感染,但βC1转基因拟南芥呈现的卷叶等类似病毒侵染的表型说明βC1能与拟南芥体内的某些因子相互作用,并诱导其产生病毒症状,最后影响植物生长发育的机制与其在天然宿主中的作用机制相近。本研究主要是通过酵母双杂交的方法,从拟南芥的cDNA文库中筛选与βC1相互作用的蛋白,来探究βC1的复杂功能,研究内容主要包括四个方面:(1)构建诱饵蛋白βC1表达载体。经检测,实验中构建的两个诱饵蛋白βC1表达载体—pGADT7-βC1、pGBKT7-βC1,对酵母菌都没有细胞毒性,但pGADT7-βC1载体对报告基因His3和Ade2有自激活,而pGBKT7-βC1载体对报告基因His3和Ade2没有自激活,于是选择pGBKT7-βC1进行后续实验。(2)构建cDNA文库表达载体。参考资料合成了4个引物,并将引物Rec1/Rec4,Rec2/Rec3分别通过磷酸化、退火配对,合成同源臂Rec,纯化回收后与经Eco R I和Xba I处理的pGADT7载体共同转化到大肠杆菌DH5α中,最后经酶切检测和测序得到正确的重组载体pGADT7 Rec,用于dsDNA的表达。(3)制备酵母cDNA文库。将收集的拟南芥植物材料进行总RNA提取、m RNA分离、反转录和PCR扩增得到dsDNA,再通过同源重组的方式使pGADT7 Rec和dsDNA在酵母菌Y187中重组,最后收集全部酵母菌,即构建的酵母cDNA文库,于-80℃冻存。(4)酵母cDNA文库筛选。将含有pGBKT7-βC1的诱饵菌和文库菌进行杂交,经缺陷型筛选培养、PCR、酶切检测、*** DH5α转化筛选等方法筛选出阳性克隆,并对其中的文库质粒测序,然后通过序列比对、分析筛选出的候选蛋白。本研究最终从拟南芥的酵母cDNA文库中筛选出16个候选蛋白,主要包括以下几类:维管束运输相关通路、r RNA成熟通路、转录因子、植物激素合成途径和植物胁迫响应通路的相关因子。本次研究结果为以后更深入地进行βC1病毒因子与植物相互作用机制研究提供了基础,在植物抗病研究上也具有一定的应用价值。

关键词：中国番茄黄化曲叶病毒 β卫星DNA βC1 酵母双杂交

烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染普通烟植株的转录组及小RNA比较分析

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烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染普通烟植株的转录组及小RNA比较分...

作者：茹宁辰河南科技大学

学位级别：硕士

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius),半翅目,粉虱科,是一个由数十个隐存种组成的复合群,其中MED隐种烟粉虱因其扩散能力强及对本地种群快速取代的能力而成为危害我国农业生产的主要入侵害虫之一。烟粉虱利用刺吸式口器吸取植物韧皮部汁液... 详细信息

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius),半翅目,粉虱科,是一个由数十个隐存种组成的复合群,其中MED隐种烟粉虱因其扩散能力强及对本地种群快速取代的能力而成为危害我国农业生产的主要入侵害虫之一。烟粉虱利用刺吸式口器吸取植物韧皮部汁液及传播植物病毒而影响植物生长,其中中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)就是由烟粉虱传播且在我国严重发生的一种双生病毒。在长期进化过程中,植物也形成了一套可遗传的抗性机制以抵御外界环境压力,其中防御蛋白及次生代谢产物是防御反应的重要组成部分,而这些化学物质的合成则受到转录的严格调控,部分micro RNA(miRNA)也会参与其中。迄今为止,有关烟粉虱取食及其TYLCCNV共侵染对普通烟植株的转录及miRNA影响还知之甚少。故此,本研究首先研究了烟粉虱在健康及TYLCCNV侵染的普通烟植株上的生物学特性,进而从转录水平及miRNA水平分析和鉴定了普通烟植株对烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染的防御机制。主要研究结果如下:(1)烟粉虱在健康和TYLCCNV侵染普通烟植株上的生物学特性:烟粉虱雌成虫在TYLCCNV侵染普通烟植株上的平均单雌产卵量及寿命分别是其在健康普通烟植株上的3.08倍和2.52倍;烟粉虱由卵发育到成虫的存活率和发育历期在健康及TYLCCNV侵染普通烟植株间均无显著差异;单头MED隐种烟粉虱不能将TYLCCNV成功传播于健康普通烟,但在10头/株和30头/株处理时可将TYLCCNV成功传播于健康普通烟植株,但传毒率相对较低,50头/株处理时,传毒率也仅为21.8%。(2)烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染对普通烟植株的转录响应差异:对烟粉虱取食的普通烟植株(TB)、烟粉虱与TYLCCNV共侵染的普通烟植株(TBV)及对照植株(TC)进行转录组测序结果分析,在TB vs TC中,鉴定出差异表达的Unigenes共有4043个,其中有2433个Unigenes上调,1610个Unigenes下调;在TBV vs TC中差异表达的Unigenes共有6853个,其中有4370个Unigenes上调,2483个Unigenes下调;在TBV vs TB中差异表达的Unigenes共有9198个,其中有4870个Unigenes上调,4328个Unigenes下调。通过对差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行GO、KEGG富集分析发现,DEGs的功能主要富集在植物病原互作、MAPK信号通路、淀粉和蔗糖代谢、苯丙类生物合成、DNA复制及谷胱甘肽代谢等途径。对富集的具有防御功能的基因进行差异表达分析发现,烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染普通烟植株后其防御功能基因的上调和下调情况差异显著,说明普通烟植株可通过不同的防御途径来应对烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染。(3)烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染对普通烟植株的miRNA响应差异:对烟粉虱取食的普通烟植株(TB)、烟粉虱与TYLCCNV共侵染的普通烟植株(TBV)及对照植株(TC)进行miRNA测序结果分析,鉴定出516条差异表达miRNA。在TB vs TC中差异基因数目为24,上调12个,下调12个;在TBV vs TC中的差异基因数目为186,上调81个,下调105个;在TBV vs TB中的差异基因数目为157,上调54个,下调103个。其中发现miR166、miR156、miR159等在植物抗病、抗虫胁迫及生长发育方面有重要作用的miRNA显著差异表达,说明miRNA在普通烟响应烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染胁迫中发挥重要作用。本研究通过对烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染后的普通烟进行转录组和miRNA测序并进行相关的生物学信息分析,从转录水平及miRNA水平上分析了普通烟植株应对烟粉虱取食及其与TYLCCNV共侵染的防御机制,该研究为烟粉虱-双生病毒-宿主植物三者之间的互作机制研究提供了新的理论依据。

关键词：烟粉虱中国番茄黄化曲叶病毒普通烟转录组 miRNA

双生病毒（geminiviruses）的种群遗传结构和变异

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双生病毒（geminiviruses）的种群遗传结构和变异

作者：葛林梅浙江大学

学位级别：硕士

大量研究证明植物,特别是动物RNA病毒的种群遗传多样性丰富,其种群结构表现为准种(quasispecies)特征。RNA病毒的高度易变性与其自身编码的复制酶缺乏校正功能相关。双生病毒(geminiviruses)是一类单链DNA病毒,其复制方式有别于植物RNA... 详细信息

大量研究证明植物,特别是动物RNA病毒的种群遗传多样性丰富,其种群结构表现为准种(quasispecies)特征。RNA病毒的高度易变性与其自身编码的复制酶缺乏校正功能相关。双生病毒(geminiviruses)是一类单链DNA病毒,其复制方式有别于植物RNA病毒,他们是利用寄主植物的DNA复制酶复制,理论上其忠实性远高于RNA病毒。然而,最近有作者以田间自然感染植物为材料研究双生病毒的种群变异结果对这种假说提出了挑战。由于证据有限,以及田间材料混合感染和重复感染事件等不可避免的因素会干扰研究结果的分析,使已有的结果不足以确定双生病毒的种群遗传结构特征。本论文通过人工接种序列一致的中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV),分离物Y10的浸染性克隆,对其在控制条件下的种群遗传结构、种群遗传多样性水平和变异规律进行了研究。结果表明,在接种本氏烟60天,3株本氏烟中的病毒群体均是杂合的,原始序列(接种克隆的序列)仍然为主序列,在群体中占主导地位,与之相伴的是一些序列接近,但不完全一致的变异体。种群变异性或遗传多样性,以突变的克隆百分率和突变频率为指标,在分析的3株本氏烟中非常的相近,平均分别为40%和4.54×10,与已报道的植物RNA病毒具可比性。为验TYLCCNV Y10 DNA-A的这种群体结构特征是否仅仅是在本氏烟上所特有的,我们还分析了1株接种60天的番茄上的病毒群体结构和遗传多样性,证明杂合群体在番茄中同样存在,突变的克隆百分率和突变频率分别为35%和4.05×10,没有因寄主的不同而变化。为进一步验证TYLCCNV的种群遗传结构特点,我们还分析自然感染TYLCCNV的番茄中的病毒群体,发现存在两个遗传上显然不同的亚群体,推测可能是重复感染或混合感染的结果。对其中占主导地位的亚群体进行遗传多样性分析,发现其突变的克隆百分率和突变频率分别为28.6%和2.63×10,与实验条件下所得的结果具有可比性。为了解群体结构和群体遗传多样性是否随着侵染的进行而发生变化,我们还在接种后120天分析了其中1株本氏烟中的群体结构和多样性水平。结果发现,群体的杂合性并没改变,群体的遗传多样性稍有增加,但是统计检验表明其差异并没有显著。推测一旦建立感染后,种群多样性对一种病毒,在同一种寄主上来说

关键词：中国番茄黄化曲叶病毒 DNA-A 种群遗传结构变异甜瓜病原鉴定软腐欧氏杆菌软腐亚种

烟粉虱—寄主植物—植物双生病毒互作的生理机制初探

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烟粉虱—寄主植物—植物双生病毒互作的生理机制初探

作者：童琳浙江大学

学位级别：硕士

烟草对于入侵我国的B型烟粉虱和我国本地的ZHJ1烟粉虱均是一种适合度较低的寄主植物，但B型烟粉虱在中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)和烟草曲茎病毒(TbCSV)两种双生病毒侵染的烟草上取食，产卵量显著增加，寿命显著延长，而ZHJ1烟粉虱在... 详细信息

烟草对于入侵我国的B型烟粉虱和我国本地的ZHJ1烟粉虱均是一种适合度较低的寄主植物，但B型烟粉虱在中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)和烟草曲茎病毒(TbCSV)两种双生病毒侵染的烟草上取食，产卵量显著增加，寿命显著延长，而ZHJ1烟粉虱在感病烟草上取食，并未对其生殖和存活产生有利影响。为了探讨这两个生物型烟粉虱之间在与其所传病毒及寄主植物相互关系方面出现这些差异的生理机制，本文测定了取食健康烟草、TYLCCNV和TbCSV侵染的烟草的B型、ZHJ1烟粉虱体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)三种保护酶活性;测定了健康烟草和双生病毒侵染后的烟草韧皮部汁液中各游离氨基酸的含量和组成，以及取食不同处理烟草后B型和ZHJ1烟粉虱分泌的蜜露中的氨基酸含量和组成。结果如下：(1)保护酶活性测定结果表明，B型烟粉虱从棉花转移到健康或被病毒感染的烟草上后，体内SOD活性均显著上升，而且取食TYLCCNV、TbCSV感病烟草的烟粉虱酶活在1d时比取食健康烟草的显著高。而ZHJ1烟粉虱从棉花转移到健康或被病毒感染的烟草上后，体内SOD活性均显著下降，取食TYLCCNV、TbCSV感病烟草的烟粉虱酶活显著高于取食健康烟草的，但仍显著低于取食棉花的酶活。B型烟粉虱转移到烟草上取食诱导了其体内CAT活性，且双生病毒对植株感染进一步增强了这种诱导作用;POD也在双生病毒的影响下受到激活，而健康植株上没有这种情况出现。在ZHJ1烟粉虱中，虽然CAT活性的变化与B型的类似，双生病毒对其呈现有利作用，且双生病毒对POD的激活作用在转移1d后就明显地表现出来，但是可能由于SOD的低活性水平，使这两种酶活性变化的有利作用未能表现出来。SOD、CAT和POD活性的差异可能是B型烟粉虱在感病植株上取食后寿命增长、生殖力增加，而ZHJ1烟粉虱没有这种情况出现的一个原因。(2)TYLCCNV侵染的植株韧皮部汁液中氨基酸总量显著高于健康烟草，TbCSV侵染的植株中氨基酸总量显著低于健康烟草，并且各种游离氨基酸的变化也不一致，不过，这两种双生病毒对植物中氨基酸的组成比例的影响大多一致，因此，氨基酸的组成比例对烟粉虱的影响可能比氨基酸含量的大。Val、Met和Lys三种必需氨基酸在两种感病植株中的含量显著上升，它们可能是有利于烟粉虱生长发育的游离氨基酸。(3)TYLCCNV感病植株中氨基酸总量高于健康烟草，取食后的B型烟粉虱所分泌的蜜露中氨基酸总量较取食健康烟草的低，ZHJ1烟粉虱蜜露中氨基酸总量没有显著改变;TbCSV感病植株中氨基酸总量低于健康烟草，取食后的B型与ZHJ1烟粉虱蜜露中氨基酸总量均较健康烟草上的低，且ZHJ1烟粉虱蜜露的氨基酸总量降低幅度显著小于B型烟粉虱。这可能是由于双生病毒的存在使B型烟粉虱能够更好地吸收利用食物中的氨基酸，但对ZHJ1烟粉虱作用不明显。在双生病毒侵染的植株上取食的B型烟粉虱能更好地利用食物中的氨基酸，而ZHJ1烟粉虱没有这种机制存在，它所吸收的营养更多地以蜜露的形式排出体外而没有得到很好的利用。本研究的创新之处：(1)首次以比较研究入侵的B型烟粉虱和土著ZHJ1烟粉虱在“媒介昆虫—病毒—寄主植物”互作中生理反应的异同为切入点，探讨B型烟粉虱与所传病毒间出现互惠共生的生理机制。(2)比较了B型烟粉虱和ZHJ1烟粉虱取食TYLCCNV或TbCSV病毒侵染的植株后体内保护酶活性的动态变化，发现各处理中B型烟粉虱体内SOD活性均比ZHJ1的显著高，这可能是B型烟粉虱寄主适应能力高于本地ZHJ1烟粉虱的一个重要因素。(3)测定了TYLCCNV和TbCSV两种双生病毒对植物体内氨基酸的组成及含量影响，比较了B型烟粉虱和ZHJ1烟粉虱取食健康植株与感病植株后所分泌的蜜露中氨基酸含量和比例，结果初步表明，B型烟粉虱在被病毒感染的植株上取食，对氨基酸的利用能力比在健康植株上取食的高，而ZHJ1烟粉虱没有这种情况存在，这有助于解释B型烟粉虱入侵并取代本地ZHJ1烟粉虱的机制。

关键词：烟粉虱 B生物型 ZHJ1生物型中国番茄黄化曲叶病毒烟草曲茎病毒超氧化物歧化酶过氧化氢酶过氧化物酶氨基酸

云南粉虱传双生病毒优势种变异及其与卫星分子的共进化

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云南粉虱传双生病毒优势种变异及其与卫星分子的共进化

作者：王玉昆明理工大学

学位级别：硕士

双生病毒是一类在全球广泛分布的植物单链环状DNA病毒。其中双生病毒科(Geminivirade)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒种类最多,分布最广,该属病毒也称粉虱传双生病毒(Whitefly-tansmmited geminivirus, WTGs),在全球热带、亚热带... 详细信息

双生病毒是一类在全球广泛分布的植物单链环状DNA病毒。其中双生病毒科(Geminivirade)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒种类最多,分布最广,该属病毒也称粉虱传双生病毒(Whitefly-tansmmited geminivirus, WTGs),在全球热带、亚热带气候类型区为害严重。其中我国南方地区发生频繁,并且发生范围逐步扩大。云南是粉虱传双生病毒病害的高发区,其独特的地理环境和气候类型,使其具有丰富的植物多样性,也为双生病毒的多样性提供了条件。本文探讨了云南优势双生病毒种群中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)和中国番木瓜曲叶病毒(PaLCuCNV)基因组结构、系统进化以及变异情况,并对双生病毒与其伴随的DNAβ卫星分子相互关系进行了分析,为该类病毒的监测与防控提供一定的理论依据。 2009～2010年间,在云南红河、大理、楚雄、德宏、保山等地表现典型双生病毒为害症状的番茄、辣椒、菜豆等作物以及田间杂草赛葵、胜红蓟等样品上,分离到多种双生病毒,其中TYLCCNV和PaLCuCNV检出频率较高。获得了13个TYLCCNV不同分离物的DNA-A,7个PaLCuCNV不同分离物的DNA-A,并且获得了10个双生病毒分离物以及与其伴随的卫星分子DNAβ,即TYLCCNV/DNAβ、烟草曲茎病毒(TbCSV)/DNAβ、赛葵黄脉病毒(MYVV)/DNAβ、云南赛葵黄脉病毒(MYVYNV)/DNAβ。这些病毒基因组都具有典型的粉虱传双生病毒基因组结构特征。对13个TYLCCNV分离物进行了种内遗传多样性分析,其DNA-A的核苷酸相似性在88.4%-99.9%之间。该病毒在云南的分布具有明显的地理差异,不同的气候类型区病毒的变异情况也不相同,另外该病毒没有表现出明显的寄主依赖性。对其变异进行了分析,发现其突变和重组的区域主要集中在IR、AV1、AC1。对7个PaLCuCNV进行了比较,发现它们的DNA-A突变较小,其DNA-A的核苷酸相似性在99.1%-99.8%之间,与广西、福建、河南的分离物核苷酸序列相似性均较高,在91.3%-99.9%之间。从重组情况看,PaLCuCNV与侵染胜红蓟的一些双生病毒存在密切的关系。比较10个begomoviruses/DNAβ复合体发现,10个病毒分离物DNA-A序列相似性在72.4%-99.3%,10个DNAβ序列的相似性在50.5%-98.7之间,DNAβ的相似性低于DNA-A的相似性,DNAβ的变异较大。从构建的系统进化树可以看出,DNAβ的聚簇方式与辅助病毒DNA-A的聚簇方式基本一致,说明二者是共进化的。此外,βC1与DNAβ也存在共进化关系,二者的系统进化树聚簇方式一致。

关键词：粉虱传双生病毒中国番茄黄化曲叶病毒中国番木瓜曲叶病毒共进化