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三年桐EST-SSR标记的开发与种质遗传多样性分析

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植物遗传资源学报 2016年第4期17卷 625-636页

作者：贾宝光林青谭晓风李泽龙洪旭向晖张琳中南林业科技大学/经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室/经济林育种与栽培国家林业局重点实验室/经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心湖南长沙410004

以三年桐品种对年桐发育中的种子为材料,构建c DNA文库,获得3202个原始EST序列,经过去除冗余和低质量序列后,获得1047条非冗余单一序列,利用MISA软件从其中的173个非冗余EST序列中搜索得到212个SSR位点。其中,二核苷酸重复类型为主导（6... 详细信息

以三年桐品种对年桐发育中的种子为材料,构建c DNA文库,获得3202个原始EST序列,经过去除冗余和低质量序列后,获得1047条非冗余单一序列,利用MISA软件从其中的173个非冗余EST序列中搜索得到212个SSR位点。其中,二核苷酸重复类型为主导（68.39%）,其次是三核苷酸重复类型（25.94%）,其优势基元为AG/CT（43.87%）、AT/AT（19.34%）和AGC/GCT（5.66%）。针对可设计引物的68个序列进行EST-SSR引物设计,结合PCR扩增和数据分析,鉴定出14对多态性标记,用该14对引物对169份三年桐种质资源进行遗传多样性检测,共得到41个等位基因（Na）,平均每对引物扩增出2.93个等位基因,期望杂合度（He）变幅为0.08~0.63,平均值为0.33,多态性信息含量（PIC）变幅为0.08~0.56,平均值为0.3,表明14对EST-SSR标记多态性较高,能较好地反映三年桐种质的遗传多样性。三年桐种质资源按群体进行非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析,群体间的相似度变幅为0.9604~0.9986,遗传距离变幅为0.0022~0.0404,表明三年桐群体间的遗传多样性相对较低,亲缘关系较近。对169份三年桐种质资源个体进行聚类分析,结果显示不同地理种源的遗传关系缺乏明显的地理结构。

关键词：三年桐 EST-SSR标记多态性信息含量遗传多样性

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三年桐根系遗传转化技术研究

三年桐根系遗传转化技术研究

作者：贾宏宇中南林业科技大学

学位级别：硕士

三年桐（Verniciafordii）为大戟科油桐属植物,是重要的木本工业用油树种,其种仁富含油脂,含油率40%-70%。从种仁中提取的油脂称为桐油,作为优质的干性油,可用于生产桐油环保油漆。然而三年桐缺乏高产单株,难以满足市场对桐油的需求,严... 详细信息

三年桐（Verniciafordii）为大戟科油桐属植物,是重要的木本工业用油树种,其种仁富含油脂,含油率40%-70%。从种仁中提取的油脂称为桐油,作为优质的干性油,可用于生产桐油环保油漆。然而三年桐缺乏高产单株,难以满足市场对桐油的需求,严重制约了桐油产业的发展。基于三年桐分子遗传改良的手段培育高产三年桐单株,是解决桐油产量低的有效途径。本论文利用发根农杆菌K599菌株,首次建立了三年桐转基因不定根诱导的遗传转化技术。该技术可为油桐功能基因的挖掘鉴定提供便捷平台,有利于今后油桐分子育种工作的快速开展。本论文的主要研究结果如下:1.三年桐不定根遗传转化技术的建立。我们以油桐基地混收的三年桐种子萌发幼苗为研究对象。基于冻融法获取含pSAK277-RFP质粒（含红色荧光蛋白报告基因）的发根农杆菌K599,利用该菌株制备侵染菌液,体外直接注射三年桐幼嫩茎段。培养2个月后利用双荧光蛋白观测灯快速锁定转基因不定根,并进一步在DNA、RNA水平鉴定和激光共聚焦显微镜观察后验证转基因不定根的真实性。基于50株三年桐幼苗处理结果发现:1)该技术转基因不定根转化效率为13.96%;2)注射部位持续保湿是不定根成功诱导的关键因素;3)菌液OD值、三年桐苗龄、注射部位均可能影响转基因不定根转化效率。2.三年桐不定根遗传转化技术的优化。从菌液浓度OD600值（0.05、0.1、0.2、0.3）、幼苗年龄（14 d、21 d、28 d、35 d苗龄）、茎干颜色（绿色、红色）和注射部位（距根0-2 cm、2-4 cm、4-6 cm、6-8 cm）设置梯度试验进行优化。结果表明:OD600为0.2时转基因不定根诱导率最高（18.15%）,21天苗龄植株的转基因不定根诱导率最高（15.94%）,注射位置距根6-8 cm时转基因不定根诱导率最高（13.96%）。综上,选择用OD600为0.2的发根农杆菌K599注射侵染21天苗龄的三年桐幼苗距根6-8 cm的茎段位置,可使转基因不定根诱导率提高到18.61%。3.三年桐不定根再生体系的探究。为了获取转基因的三年桐植株,我们尝试利用转基因不定根建立再生体系。因目前尚未解决实生苗转基因根组培污染率高的难题,所以改用无菌苗根探究根再生体系。目前的研究结果如下:1)用0.1%升汞消毒种子8 min,种子污染率为7.73%;2)以三年桐无菌根为外植体,通过设置植物激素浓度梯度发现确定三年桐根最佳愈伤诱导组合为1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D 或 1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D 愈伤诱导率最高,为50%以上;3)基于三年桐根获取的愈伤组织,我们尝试了不同的激素组合诱导分化,目前未获取可促使愈伤分化为芽的激素组合。综上所述,本论文首次建立一种简单快速获取三年桐转基因不定根的遗传转化技术。团队其他成员将继续开展转基因不定根再生为完整转基因植株的研究工作。

关键词：三年桐组织培养根系遗传转化发根农杆菌

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14个三年桐种源果实经济性状评价

种子 2017年第9期36卷 97-100页

作者：许杰王封义班启堂陈文贵州省林业科学研究院贵阳550005 望谟县林业局贵州望谟562400

以从贵州选出的12个三年桐种源和引进的2个种源为对象,调查了14个种源的果高、果径、果形指数、鲜果皮厚、鲜果重、籽重、气干果重、出籽率、仁重、出仁率、每果含籽数、仁含油率、单株果数、单株产量、冠幅平均产量、碘值、酸价17个指... 详细信息

以从贵州选出的12个三年桐种源和引进的2个种源为对象,调查了14个种源的果高、果径、果形指数、鲜果皮厚、鲜果重、籽重、气干果重、出籽率、仁重、出仁率、每果含籽数、仁含油率、单株果数、单株产量、冠幅平均产量、碘值、酸价17个指标,应用主成分分析法进行分析。结果表明:4个主成分累积贡献率为87.395%,可以较好地反映出14个种源17个测试指标的综合信息。综合评价结果以1、2、3、4、5、6、9号种源的综合性状最佳。

关键词：三年桐经济性状主成分分析综合评价

尖孢镰刀菌侵染后三年桐、千年桐根部比较转录组及Vf/VmLRR-RLKs初步分析

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尖孢镰刀菌侵染后三年桐、千年桐根部比较转录组及Vf/VmLRR-RLKs...

作者：朱慧萍中国林业科学研究院

学位级别：硕士

油桐(Vernicia fordii)是原产中国的世界著名工业油料树种,由其种子提炼而得的桐油是一种优质干性油,广泛用于工、农、渔、军事及医药等领域,同时因其清洁、安全、可再生等特点可作为重要的生物柴油原料。1939年以来,油桐枯萎病的爆发... 详细信息

油桐(Vernicia fordii)是原产中国的世界著名工业油料树种,由其种子提炼而得的桐油是一种优质干性油,广泛用于工、农、渔、军事及医药等领域,同时因其清洁、安全、可再生等特点可作为重要的生物柴油原料。1939年以来,油桐枯萎病的爆发使大片油桐林被毁,严重制约了油桐的种植及产业发展,且该病在2007年卷土重来,再次让我国油桐产业蒙受损失。油桐枯萎病发病历时长、分布广、危害重、损失大,多年来难以从根本上进行有效防治,从分子水平对油桐枯萎病抗性相关基因的挖掘有助于对油桐抗枯萎病机理进行解析。油桐枯萎病主要侵害三年桐,而同属的千年桐具有抗枯萎病能力。本文将油桐枯萎病病原菌[尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)]侵染感病三年桐和抗病千年桐,对侵染前后不同时期的根部组织进行RNA-seq测序,分析两个物种响应油桐枯萎病的基因表达模式及差异,发现富亮氨酸重复类受体蛋白(Leucine-rich repeat receptor-like protein,LRR-RLK)基因家族在抗病千年桐中作为中心基因参与千年桐对枯萎病的应答。我们对两个树种的LRR-RLK基因家族着重进行了比较分析。主要研究结果如下:(1)尖孢镰刀菌侵染三年桐根部不同时期转录组测序。得到258,435条转录本、133,304个gene。通过BLAST程序与公共数据库进行比对注释,分别有63.41%、56.68%和40.66%的基因比对到NR数据库、KOG数据库和GO数据库。34.00%的基因比对到KEGG数据库的1,021个酶和279个通路中。对尖孢镰刀菌侵染不同时期的三年桐根部差异表达基因分析发现,未侵染到侵染前期(F0-F1)的显著差异表达基因(|log2foldchange|>=1,P年桐根部不同时期的比较转录组测序。得到245,240条转录本、111,278个gene。通过BLAST程序与公共数据库进行比对注释,分别有70.26%、58.53%、39.06%的基因比对到NR数据库、KOG数据库和GO数据库。67.43%的基因比对到KEGG数据库的956个酶和278个通路中。对尖孢镰刀菌侵染不同时期的千年桐根部差异表达基因分析发现,未侵染到侵染中期(m0-m2)的显著差异表达基因最多,对其进行go富集,主要聚集于atp结合、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和受体活性。(3)尖孢镰刀菌侵染前后三年桐和千年桐根部比较转录组学分析。三年桐对尖孢镰刀菌侵染的响应主要是在侵染前期(f0-f1),差异表达基因以下调为主;而千年桐则持续到侵染中期(m0-m2),以上调为主。千年桐中显著差异基因更多聚集在防卫反应、多细胞的细胞壁组织、碳水化合物的代谢过程和蛋白质水解。在三年桐(57.60%,44,310/76,924)、千年桐(72.83%,44,310/60,842)中发现了44,310对直系同源基因。对三年桐、千年桐根部响应尖孢镰刀菌的基因表达方式进行k-means聚类,发现绝大多数直系同源基因表现出相同的表达模式,少数基因表达模式不同。对表达模式在两个物种中不一致的30对基因进行了qrt-pcr验证,结果与rna-seq基本一致(81.7%,49/60)。对两个物种中差异表达基因的相关性进一步分析,发现450对基因在两个物种中呈显著正相关和负相关(相关系数r>0.65orr年桐的基因共表达网络分析发现,富亮氨酸重复类受体蛋白lrr-rlk、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶d6pk为中心基因,介导的抗枯萎病反应主要涉及mapk信号通路、植物与病原菌互作、昼夜节律、钙信号通路。(4)进一步对三年桐、千年桐lrr-rlks进行初步分析。在三年桐、千年桐中分别找到230和236个lrr-rlks。vf/vmlrr-rlks的rlk结构域比lrr结构域更为保守,以rlk结构域氨基酸序列多序列比对结果构建vf/vmlrr-rlks系统发育进化树,进化树被分为16支。vf/vmlrr-rlks中,lrr结构域典型的保守基序为lxxlxlxxnxlxgxipxxlxxw/lxx,与前人总结的植物vf/vmlrr-rlks基因中lrr结构域的保守基序lxxlxlxxnxlxgxipxxlxxlxx极为相似,仅在倒数第三个氨基酸的位置会有所差异(除了“l”外,还会出现“w”)。绝大多数vf/vmlrr-rlks直系同源基因对尖孢镰刀菌侵染表现出相同的表达模式,少数基因不同。进一步的组织表达特异性分析结果显示,对尖孢镰刀菌侵染表现出不同表达模式的vflrr-rlk256、vmlrr-rl

关键词：三年桐千年桐比较转录组枯萎病 LRR-RLK

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三年桐结实规律及最佳更新年龄的确定

四川林业科技 1983年第4期9卷 42-45页

作者：何光磊万县地区油桐低产林改造技术小组

在发展油桐生产中,强调对现有资源的保护是十分必要的,但是也不可忽视适时更新.一些地方,由于更替不及时,出现了树龄严重老化,后续资源贫乏,产量日趋下降,地力不能充分发挥的现象.本文拟以桐树生长结实规律的分析提出一种合符生物学规... 详细信息

在发展油桐生产中,强调对现有资源的保护是十分必要的,但是也不可忽视适时更新.一些地方,由于更替不及时,出现了树龄严重老化,后续资源贫乏,产量日趋下降,地力不能充分发挥的现象.本文拟以桐树生长结实规律的分析提出一种合符生物学规律和经营目的,并能定量地确定桐树最佳更新年龄的方法.

关键词：三年桐单株经营期油桐属结实量结实规律树冠投影面积

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三年桐不同方向及轮次雌雄花分化比例研究

西部林业科学 1994年第1期30卷 45-47页

作者：戴益源云南省林业科学院

针对我省部分地方在管理油桐林时，有砍去第二轮以上枝干的现象，本文通过三年桐不同方向及轮次雌雄花分化比例的数量分析，认为三年桐雌雄花分化比例在整个树体上是一致的，在生产中，不能忽视对任何一方的管理，更不能砍去第二轮以上... 详细信息

针对我省部分地方在管理油桐林时，有砍去第二轮以上枝干的现象，本文通过三年桐不同方向及轮次雌雄花分化比例的数量分析，认为三年桐雌雄花分化比例在整个树体上是一致的，在生产中，不能忽视对任何一方的管理，更不能砍去第二轮以上的枝干。为定性地论证这一措施是否合理，对三年桐不同方向不同轮次的雌雄花分化比例进行了调查和分析。

关键词：三年桐雌雄花分化比例

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三年桐“三当”育苗试验初报

浙江林业科技 1983年第3期 10-11+16页

作者：张世渊象山县油桐研究所

三年桐(Aleurites fordii Hemsl.)的嫁接苗通常需要二年的培育。为加快良种繁育,降低育苗成本,我们进行了当年播种、当年嫁接、当年成苗出圃的“三当”育苗技术试验,并获得了成功。成苗率由原来的20～40％提高到80％以上。现将结果报道... 详细信息

三年桐(Aleurites fordii Hemsl.)的嫁接苗通常需要二年的培育。为加快良种繁育,降低育苗成本,我们进行了当年播种、当年嫁接、当年成苗出圃的“三当”育苗技术试验,并获得了成功。成苗率由原来的20～40％提高到80％以上。现将结果报道于下。

关键词： “三当”育苗剪砧苗期管理三年桐油桐属

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川渝地区三年桐天然群体种实变异

四川林业科技 2014年第1期35卷 6-13页

作者：武华卫辜云杰陈建国高洁罗建勋四川林业科学研究院四川成都610018

研究川渝地区12个有代表性的三年桐群体群体间和群体内的种实变异，对14个种实性状采用方差分析、多重比较、变异系数比较、重复力和相关分析等进行了统计分析。结果表明，三年桐种实性状在群体间和群体内均存在极其丰富的变异。种子的... 详细信息

研究川渝地区12个有代表性的三年桐群体群体间和群体内的种实变异，对14个种实性状采用方差分析、多重比较、变异系数比较、重复力和相关分析等进行了统计分析。结果表明，三年桐种实性状在群体间和群体内均存在极其丰富的变异。种子的形态变异较果实稳定，各性状变异系数变幅为7．89％-28．54％。群体内性状分化系数平均变异为74．26％，群体间变化幅度为6．43％-74．93％，平均性状分化系数为25．74％，群体内变异高于群体间。

关键词：三年桐群体种实变异

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不同种源三年桐种子能源品质比较

福建林业科技 2018年第3期45卷 35-40页

作者：吴文景梅辉坚王兆勇马祥庆吴鹏飞福建农林大学林学院福建福州350002 抚州市林业局森林资源监测中心江西抚州344000 福州市不动产登记和交易中心福建福州350002

为筛选产油量高且油脂品质优良的种源,选择福建南平、福建永春、福建尤溪、江西九江、河南崇县的三年桐(Vernicia fordii)种子为研究对象,测定分析不同种源三年桐种子形态、质量及油脂特性等品质指标,利用隶属函数法结合权重对其能源品... 详细信息

为筛选产油量高且油脂品质优良的种源,选择福建南平、福建永春、福建尤溪、江西九江、河南崇县的三年桐(Vernicia fordii)种子为研究对象,测定分析不同种源三年桐种子形态、质量及油脂特性等品质指标,利用隶属函数法结合权重对其能源品质进行综合评价。结果表明,福建南平种源三年桐种子百粒重较大,单粒平均质量达1. 62 g,与福建尤溪种源相接近,显著大于其余3个种源; 5个种源三年桐种子油脂提取率均较高(50. 76%~58. 41%),但福建尤溪和永春三年桐种子油脂提取率显著大于其他3个种源;不同种源三年桐能源品质差异显著,其综合评价值为福建尤溪>福建永春≈福建南平>河南崇县>江西九江。福建尤溪种源三年桐在硫质量分数、水分和运动黏度等生物柴油理化特性指标中值均较低,且该种源种子在形态、质量和油脂特性指标表现均较优良,可作为生物柴油原料的优良备选种源。

关键词：三年桐种子含油率油脂特性隶属函数法