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丁香活性组分抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的研究

中国中药杂志 2021年第5期46卷 1197-1204页

作者：赵革张丹杨小会李小芳刘明华西南医科大学附属医院药学部四川泸州646000 西南医科大学药学院药理教研室四川泸州646000

筛选丁香活性组分(active fraction from clove,AFC)对人结肠癌细胞敏感的细胞株,研究AFC对其增殖、凋亡及PI3K/Akt/mTOR(phosphoinositide 3-kinase/Akt/mechanistic target of rapamycin pathway)信号通路的影响,揭示AFC诱导人结肠癌细胞凋亡的分子机制。实验采用CCK-8法检测不同浓度的AFC的细胞毒作用;采用Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染法检测AFC诱导细胞凋亡的发生;Western blot法检测AFC单独或AFC联合IGF-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ)作用于细胞后,凋亡相关蛋白caspase-3,caspase-9,PARP(poly ADP-ribose polymerase)以及PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt,mTOR和p-mTOR蛋白表达情况。结果显示,AFC抑制作用最明显的是人结肠癌HCT116细胞,最佳作用时间为48 h;AFC处理HCT116细胞后,剂量依赖性地出现典型的细胞凋亡特征,如核染色质浓缩、核碎裂、凋亡小体的出现等;Annexin V-FITC/PI双染法结果显示,与对照组比较,50,100μg·mL^(-1)AFC组诱导HCT116细胞凋亡率显著上升(P<0.001);凋亡相关蛋白caspase-9,cleaved caspase-3,cleaved PARP均被AFC以浓度依赖方式激活,cleaved caspase-3/procaspase-3,cleaved PARP/PARP,caspase-9/β-actin在100μg·mL^(-1)AFC组与对照组间比较,差异均有统计学意义(P<0.001);p-PI3K,p-Akt,p-mTOR蛋白相对表达量呈浓度依赖性的递减,而Akt,mTOR在各组间无明显变化,p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR在50,100μg·mL^(-1)AFC组与对照组间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。联合IGF-Ⅰ,削弱了AFC抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR在AFC组和AFC+IGF-Ⅰ组间比较,差异有统计学意义(P<0.05);联合IGF-Ⅰ,AFC诱导的cleaved caspase-3,cleaved PARP蛋白表达减弱,cleaved caspase-3/procaspase-3,cleaved PARP/PARP在AFC组和AFC+IGF-Ⅰ组间比较,差异有统计学意义(P<0.01)。综上,AFC浓度相关性地激活caspase级联反应诱导人结肠癌HCT116细胞发生凋亡,凋亡发生与PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制有关。

关键词：丁香活性组分凋亡结肠癌 PI3K/Akt/mTOR通路

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丁香活性组分PEG-PLGA纳米粒抗结肠癌活性研究

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中国抗生素杂志 2024年第11期49卷 1297-1303页

作者：吴春红王健郭晓怡李健李亚玲刘明华西南医科大学药学院泸州646000 成都大学成都610106 西南医科大学附属中医医院泸州646000

目的丁香活性组分(active fraction from clove,AFC)具有明显的抗结肠癌活性,前期研究已制备AFC-PEG-PLGA纳米粒,本研究进一步系统评价AFC-PEG-PLGA纳米粒的体外、体内抗结肠癌活性。方法常规培养人结肠癌细胞HCT116、SW620、HCT8和LOVO... 详细信息

目的丁香活性组分(active fraction from clove,AFC)具有明显的抗结肠癌活性,前期研究已制备AFC-PEG-PLGA纳米粒,本研究进一步系统评价AFC-PEG-PLGA纳米粒的体外、体内抗结肠癌活性。方法常规培养人结肠癌细胞HCT116、SW620、HCT8和LOVO,以CCK-8试剂检测结肠癌细胞增殖抑制率及IC50值,筛选AFC-PEG-PLGA纳米粒敏感的结肠癌细胞;建立裸鼠HCT116结肠癌细胞移植瘤模型,随机分为阴性对照组(0.9%NS)、阳性对照组(5-氟尿嘧啶,5-Fu,30.0 mg/kg)及PEGPLGA空纳米粒对照组、AFC(100 mg/kg)、AFC-PEG-PLGA纳米粒(100 mg/kg)治疗组。每周连续给药5 d后停药2 d,给药4周,每2~3 d测量瘤径和体重1次,计算肿瘤体积(tumor volume,TV)、相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)和相对肿瘤增殖率(T/C%)。实验结束后处死动物,剥取瘤组织,称瘤重,检测AFC-PEG-PLGA纳米粒对移植瘤生长的影响。结果体外实验结果表明,AFC-PEG-PLGA纳米粒对结肠癌细胞HCT116、SW620、HCT8和LOVO的IC50为(99.58±5.48)、(145.66±6.96)、(162.62±6.58)、(229.24±9.25)μg/mL,活性最强的是HCT116细胞,活性略强于AFC。体内实验结果发现,经5-Fu、AFC与AFC-PEG-PLGA纳米粒治疗后,裸鼠TV、RTV、T/C/%及裸鼠瘤重均明显下降,其中T/C/%分别为37.54%、57.39%和43.04%,AFC-PEG-PLGA纳米粒作用强于AFC,与阴性对照组比较,P活性,以HCT116作用最强,活性强于AFC。

关键词：丁香活性组分 PEG-PLGA 纳米粒结肠癌 HCT116

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丁香活性组分抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人结肠癌细胞自噬与凋亡的研究

丁香活性组分抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人结肠癌细胞自噬与凋亡...

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作者：赵革西南医科大学

学位级别：硕士

目的:检测丁香活性组分(The active fraction from clove,AFC)对人结肠癌HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO细胞增殖的抑制作用,筛选出抑制作用最明显的HCT116细胞株;探讨丁香活性组分诱导HCT116细胞产生自噬与凋亡,并通过联合自噬特异... 详细信息

目的:检测丁香活性组分(The active fraction from clove,AFC)对人结肠癌HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO细胞增殖的抑制作用,筛选出抑制作用最明显的HCT116细胞株;探讨丁香活性组分诱导HCT116细胞产生自噬与凋亡,并通过联合自噬特异性抑制剂巴弗洛霉素A1(Baflomycin A1)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)阐明其诱导的凋亡与自噬之间的相互关系;研究丁香活性组分对人结肠癌细胞PI3K/Akt/m-TOR信号通路的影响,揭示丁香活性组分诱导人结肠癌细胞自噬与凋亡的分子机制。方法:1、细胞培养:HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO细胞株复苏后,分别用McCoy’s 5A、RPMI1640、RPMI1640、DMEM高糖、F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素链霉素液,于37℃、5%CO条件下孵箱中培养。2、细胞活力检测:(1)AFC(25、50、100、200、400μg/ml)处理各肿瘤细胞48h,CCK8法检测各肿瘤细胞的细胞增殖能力变化。(2)AFC(25、50、100μg/ml)处理HCT116细胞24、48、72h,CCK8法检测AFC对HCT116细胞细胞增殖能力的时间浓度依赖性影响。3、细胞凋亡检测:AFC(25、50、100μg/ml)作用于HCT116细胞48 h后,采用Hoechst 33258荧光染色、流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测AFC对HCT116细胞凋亡的影响;采用Western Blot检测凋亡相关蛋Caspase-3、Caspase-9、PARP的表达。4、细胞自噬检测:(1)GFP-LC3转染:Ad-mCherry-GFP-LC3B重组腺病毒转染HCT116细胞24h,加入AFC 100μg/ml继续培养48h,4%多聚甲醛固定,荧光显微镜下拍照并计数自噬斑点的数目来检测自噬水平的强弱。(2)透射电子显微镜观察:胰酶收集细胞,以2.5%的戊二醛溶液、1%四氧化锇溶液固定后,采用梯度乙醇溶液脱水,环氧树脂812包埋细胞,制成超薄切片。醋酸双氧铀和醋酸铅染色后在透射电镜观察自噬体和自噬溶酶体的形成。(3)AFC(25、50、100μg/ml)处理HCT116细胞12、24、48 h后采用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达。5、AFC诱导的细胞凋亡与自噬的相互关系:取对数生长期的HCT116细胞,将细胞分为6个组:Control组(用不含干预药物的McCoy’s 5A完全培养基培养);3-MA组(2mmol/L);BA组(Baflomycin A1 1nM);AFC组(100μg/ml);AFC+BA组(1nmol/L Baflomycin A1+100μg/mlAFC);AFC+3-MA组(2mmol/L 3-MA+100μg/mlAFC)。应用CCK8法检测各组细胞增殖能力,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,应用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达,检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP的表达。6、PI3K/Akt/mTOR信号通路活性检测:(1)AFC(25、50、100μg/ml)处理HCT116细胞48 h,Western Blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt,mTOR和p-mTOR蛋白表达情况。(2)取对数生长期的HCT116细胞,将细胞分为4个组:Control组,AFC100μg/ml组,特异性的PI3K抑制剂LY294002组(10μmol/L LY294002),AFC+LY294002组(10μmol/L LY294002+100μg/ml AFC)。Western Blot检测Akt,p-Akt,mTOR和p-mTOR蛋白表达水平。结果:1、CCK8结果显示,AFC对HCT116、SW620、HCT8、HT29、LOVO的半数抑制浓度分别是120.4±4μg/ml、174±10μg/ml、212.6±19μg/ml、232.6±27μg/ml、280.5±13μg/ml,抑制作用最明显的是人结肠癌细胞HCT116。AFC(25-100μg/ml)作用HCT116细胞24h,CCK8结果显示并未对细胞产生很明显的抑制效果;作用HCT116细胞48h,25、50、100μg/ml AFC分别能抑制细胞活力至84%±9.39%、79.31%±6.14%、69.81%±5.35%;作用HCT116细胞72h,25、50、100μg/mlAFC分别能抑制细胞活力至81.03%±7.2%、74.33%±7.51%、61.43%±4.32%;50、100μg/mlAFC组

关键词：丁香活性组分凋亡自噬结肠癌 PI3K/Akt/mTOR通路

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丁香活性组分体外抗结肠癌活性及对细胞自噬的影响

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西南医科大学学报 2023年第2期46卷 167-170,179页

作者：王健刘琳杨小会张红赵革刘明华西南医科大学药学院药理教研室泸州646000 西南医科大学附属医院药学部泸州646000

目的体外实验评价丁香活性组分(active fraction from clove,AFC)的抗结肠癌活性,探讨AFC对敏感结肠癌细胞自噬的影响。方法采用Cell Counting Kit-8 assay检测AFC对多株结肠癌细胞LOVO、HCT116、HCT8、SW620增殖的抑制作用,体外筛选敏... 详细信息

目的体外实验评价丁香活性组分(active fraction from clove,AFC)的抗结肠癌活性,探讨AFC对敏感结肠癌细胞自噬的影响。方法采用Cell Counting Kit-8 assay检测AFC对多株结肠癌细胞LOVO、HCT116、HCT8、SW620增殖的抑制作用,体外筛选敏感的人结肠癌细胞。GFP-LC3转染后荧光显微镜检测自噬水平的强弱,透射电镜观察自噬体和自噬溶酶体的形成,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达。结果AFC对LOVO、HCT116、HCT8、SW620细胞的IC50分别是280.90±12.61、113.50±7.83、211.71±7.29、174.92±9.52μg/mL,最敏感的细胞是HCT116,最佳干预时间为48 h。AFC处理细胞48 h后,荧光显微镜观察到HCT116细胞GFP-LC3转染后出现明显自噬斑点,透射电镜观察到HCT116细胞大量的自噬体和自噬溶酶体形成。Western blot结果表明,HCT116细胞AFC处理组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1相对表达量明显增高,呈现一定的时间与浓度依赖性,与对照组细胞比较差异明显(P活性较强,对HCT116细胞最敏感,可能与其上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1的表达,诱导HCT116细胞发生自噬有关。

关键词：丁香活性组分 HCT116细胞增殖自噬

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