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丁香假单胞菌番茄致病变种和烟草致病变种egfp标记突变体的构建

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丁香假单胞菌番茄致病变种和烟草致病变种egfp标记突变体的构建

作者：李江利河南农业大学

学位级别：硕士

植物病原细菌的三型分泌系统(TTSS)是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)侵染过程中重要的蛋白分泌系统。TTSS的编码、蛋白分泌等受到hrp基因的调节。研究hrp基因在病菌侵染过程中的表达情况有助于进一步探索hrp基因的功能,揭示植物病... 详细信息

植物病原细菌的三型分泌系统(TTSS)是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)侵染过程中重要的蛋白分泌系统。TTSS的编码、蛋白分泌等受到hrp基因的调节。研究hrp基因在病菌侵染过程中的表达情况有助于进一步探索hrp基因的功能,揭示植物病原细菌的分子致病机制,而egfp标记突变体的构建是开展寄主-病原物的互作研究的重要策略。本试验拟以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,以植物丁香假单胞菌烟草致病变种和番茄致病变种为材料,以其hrpA基因和hrpZ基因为靶标,通过体外重组和双亲结合技术,分别构建靶标基因与egfp融合表达的突变体,以及靶标基因缺失的egfp标记突变体,为今后研究丁香假单胞菌-植物的互作提供有用的材料工具。主要试验结果为:(1)以丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000菌株和烟草致病变种4号菌株的基因组DNA为模板,扩增出了hrpA、hrpZ基因及其上下游片段;以pEGFP-C1为模板扩增出了egfp ORF全长。将相关的DNA片段进行体外重组后,得到了4个与预期大小一致的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4,它们分别为hrpZPto::egfp、hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型片段和△hrpZPsta::egfp缺失型片段,为下一步构建融合型、缺失型突变体的构建奠定了基础。(2)试验将获得的目的大片段CDE3、CTE1、CTE3、CTE4分别连接至克隆载体pMD19-T,提取阳性克隆质粒pMD19-CDE3、pMD19-CTE1、pMD19-CTE3、pMD19-CTE4的DNA与自杀型质粒pKSM1的DNA同时进行BamHI和XbaI双酶切,切胶回收的酶切片段进行连接,得到了适于进行双亲接合所用的自杀型重组质粒pKSM-CDE3、pKSM-CTE1、pKSM-CTE3、pKSM-CTE4。(3)将含有质粒pKSM-CDE3的大肠杆菌S17-1与番茄致病变种DC3000野生型菌株进行双亲接合后获得了hrpZPto::egfp融合型突变体;将含有质粒pKSM-CTE1、pKSM-CTE3、pKSM-CTE4的大肠杆菌S17-1分别与烟草致病变种4号菌野生型菌株进行双亲结合获得了hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型突变体和△hrpZPsta::egfp缺失型突变体。将获得的4个突变体菌株划线于KB培养基(30μg/ml Nalr)上,在紫外灯下观察发现hrpAPsta::egfp融合型突变体有明显的绿色荧光,而hrpZPto::egfp、hrpAPsta::egfp融合型突变体及△hrpZPsta::egfp缺失型突变体则无绿色荧光。(4)与野生型菌株相比,以上构建的4个egfp标记突变体人工接种烟草后,pv. tomato DC3000的hrpZPto::egfp融合型突变体的过敏性诱导能力明显降低;hrpAPsta::egfp、hrpZPsta::egfp融合型突变体及△hrpZPsta::egfp缺失型突变体的致病性也明显降低。

关键词：丁香假单胞菌番茄致病变种丁香假单胞菌烟草致病变种 hrpA hrpZ egfp标记突变体

番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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园艺学报 2019年第1期46卷 182-192页

作者：柴阿丽帕提古丽郭威涛石延霞谢学文席先梅李宝聚中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081 新疆农业科学院园艺作物研究所乌鲁木齐830091 内蒙古农牧业科学院植物保护研究所呼和浩特010031

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PC... 详细信息

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PCR检测技术体系的检测灵敏度比普通PCR高1 000倍。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子中Pst的带菌量,检测下限为4.21 cfu·g^(-1);检测人工接种叶片组织中Pst的带菌量,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×102 cfu·g^(-1)。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR、普通PCR和病原菌分离检测,检测到54个样本中含有Pst,3种方法检测结果一致。结果表明,建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测番茄种子和发病组织中Pst的含量,为番茄细菌性斑点病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。

关键词：番茄丁香假单胞菌番茄致病变种实时荧光定量PCR 种子检测组织检测

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亚高温环境下番茄对细菌性斑点病病原菌的抗性变化及其机制研究

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中国蔬菜 2021年第11期 37-44页

作者：王安然史军营胡璋健王娇喻景权师恺浙江大学农业与生物技术学院浙江杭州310058

在全球气候变暖的大背景下,园艺作物在设施及露地生产中病虫害高发频发,严重威胁园艺产品的产量、品质和安全,而亚高温环境如何影响园艺作物的抗病性尚不清楚。细菌性斑点病是由丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae ***,Pst... 详细信息

在全球气候变暖的大背景下,园艺作物在设施及露地生产中病虫害高发频发,严重威胁园艺产品的产量、品质和安全,而亚高温环境如何影响园艺作物的抗病性尚不清楚。细菌性斑点病是由丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae ***,Pst)引起的在我国番茄生产中广泛发生的重要病害。本试验以含抗Pst基因Pto的高抗番茄LA3472及其背景基因型高感番茄Moneymaker为试验材料,探究亚高温环境下番茄的模式触发的免疫(PAMPs-triggered immunity,PTI)和效应蛋白触发的免疫(effector-triggered immunity,ETI)两种不同抗病途径对Pst DC3000的响应变化。结果表明:与24 ℃常温相比,30 ℃亚高温对体外培养的Pst DC3000菌株的增殖速度无明显影响,但Moneymaker和LA3472在接种Pst DC3000后,细菌性斑点病害的发生均显著加重。亚高温下,2份番茄材料的水杨酸(SA)积累量在接种病原菌后均比常温下接种显著减少,受Pst DC3000诱导的水杨酸合成基因PALs和信号转导基因NPR1的转录表达也被显著抑制。由此可见,亚高温对番茄对细菌性斑点病的不同抗性途径PTI和ETI均有抑制作用,推测其和SA抗性路径被抑制有关。本试验对于理解温度升高背景下蔬菜作物病害发生及加强病害防控具有理论和现实意义。

关键词：番茄亚高温丁香假单胞菌番茄致病变种水杨酸抗病性

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大豆γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）基因的分离及功能分析

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大豆γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）基因的分离及功能分析

作者：朱永兴西北农林科技大学

学位级别：硕士

生育酚又称维生素E,是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化剂,为人体所必需的维生素之一,它可以清除生物体内的活性氧和自由基,具有明显的抗逆作用。在天然存在的四种生育酚中,α-生育酚的生物活性最高且被人体优先吸收和利用,但大... 详细信息

生育酚又称维生素E,是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化剂,为人体所必需的维生素之一,它可以清除生物体内的活性氧和自由基,具有明显的抗逆作用。在天然存在的四种生育酚中,α-生育酚的生物活性最高且被人体优先吸收和利用,但大多数主要的植物中α-生育酚水平普遍比较低,而γ-生育酚的水平却比较高。γ-生育酚甲基转移酶的作用是催化γ-生育酚转化为α-生育酚。为了提高植物中α-生育酚的含量,我们进行了大豆γ-生育酚甲基转移酶基因的分离,获得全长cDNA序列(命名为GMTMT),并将其转化拟南芥,以及高维生素E的拟南芥是否可以增强抵抗病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae ***)的侵染实验,得到以下结果: 1.从大豆中分离了γ-生育酚甲基转移酶的全长cDNA序列,并构建了原核表达载体PET-TMT和植物表达载体PBI121-TMT,分别将其转入大肠杆菌和拟南芥中,并获得了比较高的体外酶活以及纯系转基因拟南芥1#、5#、7#、8#,ELISA检测表明,1#GMTMT基因在转基因拟南芥中表达活性最高,HPLC分析表明,转基因植株的α-生育酚含量普遍高于野生型植株,提高3-6倍。 2.以转基因拟南芥纯系植株1#、5#、7#和野生拟南芥为研究对象,采用注射法对转基因拟南芥纯系植株和野生拟南芥进行丁香假单胞菌番茄致病变种*** *** DC3000的的侵染实验,结果显示,接种病原菌三天后,转基因纯系植株和野生型均出现明显的黄化症状,接种七天后,转基因纯系植株与野生型拟南芥同样出现干枯症状。表明转基因纯系植株并没有增强对丁香假单胞菌致病变种DC3000的抗病性。 3.构建了GMTMT基因与GFP融合的植物表达载体PK7FWG2-TMT2,通过烟草叶盘转化法得到了转基因烟草30株,通过观察发现有5颗有GFP的表达,在细胞核中表达最强,其次是细胞膜。

关键词：大豆拟南芥 α-生育酚 γ-生育酚甲基转移酶丁香假单胞菌番茄致病变种

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番茄细菌性斑点病病原菌鉴定

植物病理学报 2001年第1期31卷 37-42页

作者：赵廷昌孙福在宋文生中国农业科学院植物保护研究所北京100094 东北农业大学植保系

1998～ 1999年在吉林省、辽宁省、黑龙江省等地的大棚番茄上发现一种番茄病害 ,并从其病叶、病茎杆上分离得到了 2 3个细菌菌株。接种番茄幼苗上 ,发病症状与自然发病症状完全一致 ,并从接种病株上重新分离到此病原细菌。各菌株致病力... 详细信息

1998～ 1999年在吉林省、辽宁省、黑龙江省等地的大棚番茄上发现一种番茄病害 ,并从其病叶、病茎杆上分离得到了 2 3个细菌菌株。接种番茄幼苗上 ,发病症状与自然发病症状完全一致 ,并从接种病株上重新分离到此病原细菌。各菌株致病力无明显的差异。经革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、生理生化反应、G+ C mol%等鉴定 ,确认该病原菌为丁香假单胞杆菌番茄致病变种 (Pseu-domonas syringae ***(Okabe) Young,Dye & Wilkie)。该病菌引起番茄细菌性斑点病 (又称叶斑病 )。病菌除侵染番茄外 ,尚能侵染茄子、辣椒、龙葵、白花曼陀罗和毛曼陀罗。该病害尚属我国大陆首次报道。

关键词：丁香假单胞菌番茄致病变种番茄细菌性斑点病病原菌鉴定

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