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Science China(Life Sciences) 2011年第6期54卷 520-526页

作者： WANG Nan WANG YueJu LI GangQiang SUN Ning LIU DeHu biotechnology Research Institute Chinese Academy of Agricultural SciencesBeijing 100081China Department of Natural Sciences Northeastern State UniversityBroken ArrowOklahoma 74014USA

Lysozyme is an enzyme that is essential for protection against bacterial *** this study,a T4 lysozyme gene was cloned into the yeast expression vector pPIC9K under the control of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter (pGAP).A Hansenula polymorpha-derived ribosomal DNA (rDNA)-targeting element was inserted into the expression vector and was critical for stable DNA integration into the *** *** T4 lysozyme was successfully expressed in the yeast *** A16;0.49 g L-1 secreted recombinant T4 lysozyme was obtained 72 h after incubation in culture broth that had an initial pH of *** T4 lysozyme showed lytic activity against the cell walls of the gram positive bacteria,Micrococcus lysodeikticus,and the gram negative bacteria Xanthomonas campestris *** and Xanthomonas oryzae *** zone of inhibition assay was used to evaluate antimicrobial *** spectrometry showed the N-terminal sequence of recombinant T4 lysozyme was identical to that of the native ***-PAGE indicated that the molecular mass of recombinant T4 lysozyme was 18.7 kD which corresponds to a monomer of the native ***-PAGE without 0.2 mol L-1 dithiothreitol treatment detected two bands (15 and 31 kD) suggesting that some recombinant T4 lysozyme formed interand intra-molecular disulfide bonds which resulted in loss of enzyme activity.

关键词： T4 lysozyme antimicrobial activity Hansenula polymorpha pGAP rDNA

木榄ERF转录因子基因的克隆及功能分析初探

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中国农业科技导报 2012年第4期14卷 66-72页

作者：赵杨敏庞俊峰张占路姬澎尉亚辉吴燕民西北大学生命科学学院西安710069 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 深圳市农科集团有限公司深圳518040

利用RACE-PCR技术,以深圳红树自然保护区的木榄为材料,克隆出一个ERF类转录因子基因的cDNA全长序列,命名为bgERF(Genbank序列号:GU593720)。生物信息学分析表明:该基因全长1 870 bp,完整开放阅读框1 425 bp,具有一个保守的AP2/EREbP结构... 详细信息

利用RACE-PCR技术,以深圳红树自然保护区的木榄为材料,克隆出一个ERF类转录因子基因的cDNA全长序列,命名为bgERF(Genbank序列号:GU593720)。生物信息学分析表明:该基因全长1 870 bp,完整开放阅读框1 425 bp,具有一个保守的AP2/EREbP结构域,且编码的由475个氨基酸组成的蛋白具有典型的1个α螺旋,3个β转角的三维结构,在AP2/EREbP结构域的第14位为丙氨酸(A),第19位为天冬氨酸(D),属于AP2/EREbPF蛋白家族中的ERF类转录因子;NCbI-bLAST比对结果表明:该基因与胡萝卜、拟南芥、水稻、辣椒、番茄、大豆、马铃薯、陆地棉等植物ERF类转录因子具有较高的同源性;并构建了高效植物表达载体PbI121-35s-bgERF,获得的转基因烟草与野生型相比,表现出明显的耐盐性,为该基因功能的深入分析和耐盐机理的研究奠定了基础。

关键词：木榄 RACE-PCR技术 AP2/EREbPF蛋白 ERF转录因子生物信息学

新牧一号杂花苜蓿MvNHX1基因的表达分析和提高烟草耐盐性的研究

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植物研究 2011年第5期31卷 550-557页

作者：张桦张富春张雨良张博陈全家新疆草地资源与生态重点实验室乌鲁木齐830052 新疆农业大学农业生物技术重点实验室乌鲁木齐830052 新疆生物资源基因工程重点实验室、新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

提取新牧一号杂花苜蓿的总RNA,用特异引物RT-PCR扩增后的cDNA片段连接入pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α,对阳性克隆进行序列分析,新牧一号苜蓿NHX1(MvNHX1)全长1 626 bp,Genbank登录号为:EU375310。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR分析表... 详细信息

提取新牧一号杂花苜蓿的总RNA,用特异引物RT-PCR扩增后的cDNA片段连接入pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α,对阳性克隆进行序列分析,新牧一号苜蓿NHX1(MvNHX1)全长1 626 bp,Genbank登录号为:EU375310。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR分析表明,在盐胁迫下MvNHX1基因的表达均上调。构建重组植物表达载体pbI121-MvNHX1后,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,转基因烟草在盐胁迫下发芽率和生物量均高于非转基因烟草,表明MvNHX1能够提高转基因烟草的耐盐性。

关键词：新牧一号苜蓿 MvNHX1 克隆序列分析耐盐性

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木榄CaM基因的克隆及序列分析

生物技术通报 2010年第12期26卷 126-131页

作者：庞俊峰于卓张占路房永雨唐益雄吴燕民内蒙古农业大学农学院呼和浩特010019 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 深圳市农科集团公司深圳518040

以深圳红树自然保护区的木榄为材料,根据Genbank上已公布的钙调蛋白氨基酸保守区的碱基序列设计引物,RT-PCR扩增木榄CaM序列,获得cDNA全长735bp,命名为bgCaM(Genbank登录号:GU722140)。生物信息学分析表明,bgCaM与拟南芥、花生、大麦、... 详细信息

以深圳红树自然保护区的木榄为材料,根据Genbank上已公布的钙调蛋白氨基酸保守区的碱基序列设计引物,RT-PCR扩增木榄CaM序列,获得cDNA全长735bp,命名为bgCaM(Genbank登录号:GU722140)。生物信息学分析表明,bgCaM与拟南芥、花生、大麦、榉木及甘薯等植物钙调蛋白氨基酸保守区具有较高同源性。bgCaM基因完整开放阅读框为450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白等电点为4.11,分子量为16.8kD。分析基因序列和相应酶切位点,将扩增获得的bgCaM基因完整开放阅读框与中间表达载体相应酶切产物进行连接,构建植物表达载体pC13rd29A-bgCaM,为bgCaM功能分析和进一步利用奠定了基础,为植物转基因研究与应用又增添了一个新的基因源。

关键词：木榄钙调蛋白基因克隆生物信息学载体构建

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外源基因在烟草绿色组织中的高效表达研究

生物技术通报 2011年第6期27卷 80-87页

作者：杨大伟周焘张锐罗淑萍郭三堆中国农业科学院生物技术研究所农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程北京100086 新疆农业大学乌鲁木齐830052

研究外源基因在受体绿色组织中的特异表达情况,分别构建由棉花PsbP启动子驱动的GUS基因及CP4 epsps基因的植物表达载体pbI121-P、pbI121-PE。农杆菌介导法转化到烟草中,获得20株转pbI121载体、40株转pbI121-P载体和32株转pbI121-PE载体... 详细信息

研究外源基因在受体绿色组织中的特异表达情况,分别构建由棉花PsbP启动子驱动的GUS基因及CP4 epsps基因的植物表达载体pbI121-P、pbI121-PE。农杆菌介导法转化到烟草中,获得20株转pbI121载体、40株转pbI121-P载体和32株转pbI121-PE载体的烟草阳性植株。组织化学染色分析表明,GhPsbP启动子驱动的GUS基因只在转基因烟草的叶片和茎中表达,在根中不表达;Real-time PCR分析表明,PsbP启动子驱动CP4 epsps基因在叶和茎中的表达量分别是根中的15倍和10倍;草甘膦抗性试验证明,PsbP启动子驱动的CP4 epsps基因在烟草叶及茎的绿色组织中的表达量足以忍受1%浓度草甘膦的毒害。证明GhPsbp启动子可以有效地驱动外源基因在烟草的绿色组织中高效特异的表达。

关键词：绿色组织 GUS活性 Real-time PCR 草甘膦抗性特异表达

新牧一号苜蓿MvP5CS基因的克隆和功能分析

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草业科学 2012年第1期29卷 51-58页

作者：张桦张富春曾光张博陈全家新疆草地资源与生态重点实验室新疆乌鲁木齐830052 新疆生物资源基因工程重点实验室新疆大学生命科学与技术学院新疆乌鲁木齐830046 新疆农业大学农业生物技术重点实验室新疆乌鲁木齐830052

为研究苜蓿(Medicago sativa)耐盐分子机制,为抗逆分子育种提供依据,通过同源克隆和RT-PCR技术克隆了新牧一号杂花苜蓿(*** Xinmu-1)的MvP5CS基因,MvP5CS全长2 148bp,Genbank登录号为:EU371644。荧光定量PCR分析发现,在盐胁迫下MvP5CS... 详细信息

为研究苜蓿(Medicago sativa)耐盐分子机制,为抗逆分子育种提供依据,通过同源克隆和RT-PCR技术克隆了新牧一号杂花苜蓿(*** Xinmu-1)的MvP5CS基因,MvP5CS全长2 148bp,Genbank登录号为:EU371644。荧光定量PCR分析发现,在盐胁迫下MvP5CS基因表达明显上调,说明MvP5CS与苜蓿的耐盐性相关。利用农杆菌介导的叶盘转化法,将MvP5CS基因成功转入烟草(Nicotiana tabacum),盐胁迫下转MvP5CS基因T1代烟草萌发率和根长均高于非转基因烟草。表明新牧一号苜蓿P5CS基因能够提高转基因烟草的耐盐性。

关键词：新牧一号苜蓿 MvP5CS 克隆序列分析耐盐性

多启动子驱动苘麻epsps优化基因植物表达载体的构建及其转化

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中国农业科技导报 2013年第1期15卷 48-54页

作者：张莎莎张锐周焘郭三堆中国农业科学院生物技术研究所国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程北京100081

转基因抗草甘膦作物是商业化最广泛的转基因作物之一,但是棉花的雄蕊对草甘膦敏感,在四叶期后喷施草甘膦会造成抗草甘膦棉花雄性败育,不能正常授粉,最终导致产量降低。为降低草甘膦对棉花育性的不良影响,有针对性的构建了棉花生殖器官... 详细信息

转基因抗草甘膦作物是商业化最广泛的转基因作物之一,但是棉花的雄蕊对草甘膦敏感,在四叶期后喷施草甘膦会造成抗草甘膦棉花雄性败育,不能正常授粉,最终导致产量降低。为降低草甘膦对棉花育性的不良影响,有针对性的构建了棉花生殖器官优势表达的arf1启动子、棉花草甘膦高效诱导表达的ag2启动子和组成型启动子CaMV35S驱动苘麻epsps优化基因的串联三表达盒植物表达载体,采用农杆菌喷花法将其转入棉花,对T0代喷施草甘膦筛选获得8株对草甘膦有较强抗性并且生殖发育正常的植株;PCR和RT-PCR分析表明外源基因已整合至棉花基因组并正确表达。为探索用不同类型启动子驱动相同基因以扩大外源基因在植物中的表达范围和培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因棉花打下基础。

关键词：棉花转化草甘膦epsps 启动子载体构建

新型筛选标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因植物中的应用

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中国农业科技导报 2011年第6期13卷 12-19页

作者：郭倩倩孙熙森唐益雄吴燕民中国农业科学院生物技术研究所北京100081 新疆生产建设兵团农二师33团生产科新疆尉犁841504

广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,全面介绍了其作用原理、生... 详细信息

广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,全面介绍了其作用原理、生物安全性、在植物转化中的应用与检测等,深入分析了其在植物转化中作为筛选标记存在的问题与不足,并就其发展前景进行了展望,以期为在转基因植物中的广泛应用奠定基础。

关键词：磷酸甘露糖异构酶(PMI) 转基因植物选择标记生物安全性遗传转化

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陆地棉GhCYP1基因的分离及其表达分析

华北农学报 2011年第6期26卷 32-36页

作者：李元宝王亦学司怀军吴家和甘肃农业大学甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室甘肃兰州730070 中国科学院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室北京100101

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1。氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个... 详细信息

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1。氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个连续氨基酸所组成的单结构域亲环蛋白典型结构,且在保守区都具有PPIase活性所必需的3个氨基酸(R、F、H)以及与环孢素A(CsA)结合位点密切相关的色氨酸(W)。利用半定量RT-PCR对该基因的表达模式进行分析,发现其在棉花的叶、茎、根中均有表达,且在根中的表达量最高,暗示了该基因可能与植物根系吸水及矿物运输有关,从而在棉花适应干旱胁迫环境中发挥着关键作用。

关键词：棉花亲环蛋白干旱胁迫表达模式

T4溶菌酶在多型汉逊酵母中的表达及抑菌活性测定

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中国科学：生命科学 2011年第4期41卷 313-319页

作者：王楠王跃驹李刚强孙宁刘德虎中国农业科学院生物技术研究所北京100081 Department of Natural Sciences Northeastern State University

溶菌酶是一类对多种细菌都具有明显杀菌效果的蛋白质.本研究将T4溶菌酶基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,以汉逊酵母A16来源的rDNA序列作为同源重组序列,在毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGAP)的调控下,使T4溶菌酶在汉逊酵母A1... 详细信息

溶菌酶是一类对多种细菌都具有明显杀菌效果的蛋白质.本研究将T4溶菌酶基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,以汉逊酵母A16来源的rDNA序列作为同源重组序列,在毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGAP)的调控下,使T4溶菌酶在汉逊酵母A16中以组成型方式稳定高效表达.在37℃,pH6.0,摇瓶发酵培养72h后,表达量达到0.49g/L.结果表明,汉逊酵母能够识别源自毕赤酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和醇氧化酶终止子序列,而且rDNA作为同源重组序列可以产生多拷贝的汉逊酵母重组子.对重组蛋白进行了N端测序、质谱及SDS-PAGE检测,发现重组蛋白N端与T4溶菌酶N端氨基酸序列一致,分子量大小约为18.7kD,与预计分子量大小相符.重组T4溶菌酶对革兰氏阳性和阴性细菌都具有抑菌活性和溶壁活性.非变性SDS-PAGE(无DTT)检测发现,重组T4溶菌酶形成了分子内二硫键和少量分子间二硫键,这种不正确的二硫键可能导致重组T4溶菌酶损失部分抗菌活性.

关键词： T4溶菌酶抗菌活性汉逊酵母 pGAP rDNA