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miRNA-188-5p表达下调通过调控PTEN/Akt途径抑制皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭能力

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中华皮肤科杂志 2020年第10期53卷 801-806页

作者：程赛夏永华张孟杰张彩凤刘冬胡华杨留中新乡医学院第一附属医院皮肤性病科河南卫辉453100 新乡医学院第一附属医院消化内科河南卫辉453100 新乡医学院第一附属医院肿瘤科河南卫辉453100

目的探讨miRNA-188-5p(miR-188-5p)在皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)组织和细胞中的表达,分析其表达下调对皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法2012年11月至2018年10月在河南省新乡医学院第一附属医院收集50例手术切除的皮肤鳞癌组织及50例... 详细信息

目的探讨miRNA-188-5p(miR-188-5p)在皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)组织和细胞中的表达,分析其表达下调对皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法2012年11月至2018年10月在河南省新乡医学院第一附属医院收集50例手术切除的皮肤鳞癌组织及50例癌旁正常皮肤组织。实时荧光定量PCR(qPCR)检测皮肤鳞癌组织、癌旁正常皮肤组织、皮肤鳞癌细胞系SCL-1、A431、HSC-5和人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞中miR-188-5p的表达。培养的A431和HSC-5细胞分别分为2组:miR-188-5p抑制剂组和阴性对照组,对转染miR-188-5p抑制剂的细胞和阴性对照组细胞,通过qPCR检测miR-188-5p的相对表达(2-△△Ct),并以CCK8法和Transwell小室分别检测各组细胞的增殖活性和侵袭能力。双荧光素酶报告实验检测miR-188-5p和PTEN的相互作用,Western印迹法检测PTEN、总Akt(t-Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)的表达。两独立样本比较采用t检验。结果皮肤鳞癌组织中miR-188-5p的相对表达(5.213±3.138)显著高于癌旁正常皮肤组织(1.010±0.364,t=9.187,P<0.001)。SCL-1、A431和HSC-5细胞中miR-188-5p的表达(3.858±0.163、7.068±0.262和4.572±0.413)均显著高于HaCaT细胞(1.079±0.300,t=17.890、21.110和8.737,均P<0.05)。与阴性对照组相比,miR-188-5p抑制剂组A431和HSC-5细胞miR-188-5p表达显著下调(均P<0.01),细胞增殖和侵袭能力下降(均P<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,miR-188-5p表达下调显著上调A431和HSC-5细胞中PTEN的表达,但抑制p-Akt的表达。结论miR-188-5p在皮肤鳞癌组织和细胞中高表达,且miR-188-5p表达下调可能通过调控PTEN/Akt途径,抑制皮肤鳞癌细胞增殖活性和侵袭能力。

关键词：癌鳞状细胞微RNAs 细胞增殖细胞侵袭微小RNA-188-5p PTEN

一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法

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中国比较医学杂志 2018年第8期28卷 101-107页

作者：郭果李赛超王丽刘璐卢燎勋黄蓉新乡医学院医学检验学院河南新乡453000 临床检验诊断学河南省研究生创新实践基地河南新乡453000 河南省免疫与靶向药物重点实验室河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心河南新乡453000

目的建立一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法。方法构建针对小鼠Vav1基因的特异性打靶载体,利用脂质体转染法转染B16小鼠黑色素瘤细胞,使用流式细胞仪对GFP阳性单细胞进行分选,对得到的GFP阳性单克隆细胞使用直接裂解法获取基因... 详细信息

目的建立一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法。方法构建针对小鼠Vav1基因的特异性打靶载体,利用脂质体转染法转染B16小鼠黑色素瘤细胞,使用流式细胞仪对GFP阳性单细胞进行分选,对得到的GFP阳性单克隆细胞使用直接裂解法获取基因组DNA,将其用于荧光PCR,产物通过毛细管电泳和分析后即可快速获知其基因型。结果使用以上方法在短时间内得到了大量GFP阳性单克隆细胞,从中随机挑选16个,通过荧光PCR检测其基因型,结果表明敲除效率为87.5%;通过测序对部分荧光PCR结果进行验证,发现其基因型结果完全正确。结论将CRISPR/Cas9基因编辑系统、流式细胞仪单克隆分选、荧光PCR和大批量DNA样本处理技术结合,可以短时间内在B16小鼠黑色素瘤细胞中获得大量Vav1基因敲除稳定单克隆细胞。

关键词： CRISPR/Cas9 基因敲除 Vav1基因流式细胞仪分选荧光PCR

低氧通过上调乙酰辅酶A羧化酶1促进肺腺癌A549细胞迁移

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解剖学报 2021年第2期52卷 258-263页

作者：金家豪赵宝生刘丹辉刘玉珍新乡医学院第一附属医院新乡医学院食管癌研究所河南卫辉453100 新乡医学院第一附属医院胸外科河南卫辉453100 新乡医学院第一附属医院生命科学研究中心河南卫辉453100

目的探讨低氧通过乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)促进人肺腺癌A549细胞迁移的机制。方法低氧(5%O2)处理肺腺癌A549细胞,应用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测ACC1表达及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平。结果与常... 详细信息

目的探讨低氧通过乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)促进人肺腺癌A549细胞迁移的机制。方法低氧(5%O2)处理肺腺癌A549细胞,应用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测ACC1表达及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平。结果与常氧(对照组)相比,低氧处理促进了A549细胞的迁移(P0.05);补充亚油酸(LA)恢复低氧对A549细胞的促迁移作用(P<0.05)。结论低氧通过上调ACC1的表达促进肺腺癌A549细胞迁移及EMT转化。

关键词：低氧肺腺癌迁移乙酰辅酶A羧化酶1 免疫印迹法

妊娠期慢性酒精暴露诱发新生大鼠海马氧化应激损伤

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神经解剖学杂志 2021年第3期37卷 279-283页

作者：文政芳郭新平常宏扬谢文秀赵淑珍张全乐新乡医学院第一附属医院生殖医学科卫辉453100 新乡医学院第一附属医院妇科卫辉453100

目的:探讨妊娠大鼠慢性酒精暴露对仔鼠海马发育的的影响。方法:12只妊娠期SD大鼠随机分为对照组(control)和酒精暴露组(EtOH),利用酒精灌胃的方法制备妊娠大鼠慢性酒精暴露模型,根据体重和身长评估仔鼠的发育情况,利用商品化试剂盒检测... 详细信息

目的:探讨妊娠大鼠慢性酒精暴露对仔鼠海马发育的的影响。方法:12只妊娠期SD大鼠随机分为对照组(control)和酒精暴露组(EtOH),利用酒精灌胃的方法制备妊娠大鼠慢性酒精暴露模型,根据体重和身长评估仔鼠的发育情况,利用商品化试剂盒检测新生大鼠海马反应性活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量,利用real time RT-PCR检测海马组织中NADPH氧化酶1(NOX-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达,利用Western Blot检测海马组织中凋亡相关分子cleaved caspase-3和Bcl-2的表达。结果:酒精暴露组妊娠大鼠生下的仔鼠体重和身长均小于对照组,仔鼠海马组织中ROS和MDA增加,NOX-1和iNOS mRNA的表达增加,cleaved caspase-3蛋白表达上调而Bcl-2蛋白下调。结论:妊娠大鼠慢性酒精暴露可对仔鼠海马造成损伤,其作用机制与酒精诱发氧化应激反应有关。

关键词：妊娠酒精暴露海马氧化应激新生大鼠

N-乙酰半胱氨酸通过海马区Notch1/hes1通路改善丙戊酸孤独症模型鼠的学习和记忆能力

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中国临床解剖学杂志 2019年第4期37卷 390-396页

作者：项哲张应花何雪玲王丽君崔卫刚新乡医学院基础医学院新乡医学院河南省医用组织再生重点实验室新乡市分子神经病学重点实验室

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)能否改善孤独症模型鼠的学习和记忆能力及其作用机制。方法利用丙戊酸(valproic acid,VPA)建立孤独症模型,通过三箱实验鉴定造模成功,Western blotting技术检测模型鼠海马区Notch1/hes1通... 详细信息

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)能否改善孤独症模型鼠的学习和记忆能力及其作用机制。方法利用丙戊酸(valproic acid,VPA)建立孤独症模型,通过三箱实验鉴定造模成功,Western blotting技术检测模型鼠海马区Notch1/hes1通路信号分子Notch1、Notch1胞内活性结构域(Notch intracellular domain,NICD)、Hes1、Jagged1变化,免疫荧光技术检测该通路信号下游靶基因Hes1的表达;然后用NAC干预,检测模型鼠学习和记忆能力的变化及Notch1/hes1信号通路关键信号分子的改变。结果与对照组相比,VPA组大鼠找到平台的时间增加,跨越平台的次数及在靶象限的时间均减少,同时Notch1、NICD、Hes1、Jagged1的蛋白表达水平增加;而NAC干预以后,与VPA组相比,VPA+NAC组大鼠找到平台的时间减少,跨越平台的次数及在靶象限的时间均增加,同时海马脑区NICD、Hes1的蛋白表达均下降。结论 NAC可以改善VPA孤独症模型鼠学习和记忆能力,其作用机制可能与降低Notch1/hes1信号通路的过度活化有关。

关键词：孤独症 N-乙酰半胱氨酸 Notch1 丙戊酸学习记忆能力

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弓形虫肌动蛋白表达及其抗血清制备

中国公共卫生 2013年第3期29卷 378-380页

作者：尹志奎赵林静郑斌新乡医学院药理学教研室河南新乡453003 新乡医学院寄生虫学教研室

目的体外制备弓形虫肌动蛋白(actin)及其多克隆抗体。方法以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增actin基因,亚克隆至pET30a载体,转化到大肠埃希菌BL21中;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达actin-His6蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大... 详细信息

目的体外制备弓形虫肌动蛋白(actin)及其多克隆抗体。方法以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增actin基因,亚克隆至pET30a载体,转化到大肠埃希菌BL21中;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达actin-His6蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大鼠,收集抗血清,制备多克隆抗体,抗体亲和纯化柱纯化并分析抗体的效价。结果 actin基因的PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,在1 000 bp附近有一条带,与目的基因(actin cDNA长度为1 131 bp)大小相符;actin/pET30a重组质粒经BamHI和XhoI双酶切,1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物,在1 000和5 000 bp附近可见条带;actin-His6蛋白在3～4 h时表达量达到峰值;蛋白可溶性分析显示,actin-His6蛋白主要以包涵体的形式存在;获得了抗actin-His6蛋白的大鼠源性抗血清。结论弓形虫actin蛋白在原核系统中得到了表达,用该蛋白免疫动物后获得了抗血清。

关键词：弓形虫肌动蛋白蛋白表达多克隆抗体

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核内转录因子IKAROS与血液肿瘤

中国生物化学与分子生物学报 2017年第4期33卷 342-347页

作者：王海军宋娜钟加滕新乡医学院基础医学院河南新乡453003

IKAROS蛋白是一类含锌指结构域的核内转录因子,调节血液细胞分化发育。机体在血液细胞分化发育、天然免疫细胞的分化成熟、抗血液系统肿瘤发生等过程中均需要IKAROS蛋白的参与。IKAROS蛋白的功能依赖于其分子结构上的2个重要结构域:DNA... 详细信息

IKAROS蛋白是一类含锌指结构域的核内转录因子,调节血液细胞分化发育。机体在血液细胞分化发育、天然免疫细胞的分化成熟、抗血液系统肿瘤发生等过程中均需要IKAROS蛋白的参与。IKAROS蛋白的功能依赖于其分子结构上的2个重要结构域:DNA结合结构域和家族蛋白相互作用结构域。DNA结合结构域与靶基因上游调控序列进行特异性结合,而蛋白相互作用结构域与家族蛋白分子结合形成二聚体,发挥IKAROS的生物学活性。IKAROS蛋白在细胞内代谢受到酪蛋白激酶2(casein kinase 2,CK2)和蛋白磷酸化酶1(protein phosphorylase 1,PP1)的调节,CK2将IKAROS蛋白磷酸化,使其失去生物活性;而PP1将磷酸化的IKAROS蛋白去磷酸化,从而增强IKAROS的生物活性。近几年临床研究发现,IKAROS蛋白的表达异常以及CK2激酶活性的增高与白血病的发生发展有密切关系。本文就IKAROS的分子结构特点、生物学功能、体内代谢调控方式及IKAROS在血液系统肿瘤发生发展过程中的生物学作用进行综述。

关键词： IKAROS蛋白血液肿瘤结构功能基因调控研究进展

酒依赖患者记忆损害与NMDA受体2B亚基表达的关系研究

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中华行为医学与脑科学杂志 2015年第9期24卷 805-807页

作者：徐亚辉王传升张三强刘铁桥郝伟张瑞岭新乡医学院第二附属医院成瘾医学科新乡453002 新乡医学院第二附属医院内科新乡453002 湘雅二医院精神卫生研究所

目的探讨洒依赖患者记忆损害的特点,及其与N-甲基-D天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体2B亚基（NR2B）表达的关系,为临床治疗酒依赖相关的记忆损害提供新的思路.方法分别采用韦氏记忆量表（Wechsler memory scale,WMS）和逆... 详细信息

目的探讨洒依赖患者记忆损害的特点,及其与N-甲基-D天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体2B亚基（NR2B）表达的关系,为临床治疗酒依赖相关的记忆损害提供新的思路.方法分别采用韦氏记忆量表（Wechsler memory scale,WMS）和逆转录定量PCR（quantitative reverse transcription-poly-merase chain reaction,qRT-PCR）对35例住院治疗的酒依赖患者及32例匹配的正常对照者进行记忆功能评定,采用荧光定量PCR检测NR2B表达水平.结果与对照组记忆商（memory quotient,MQ）[（69.45±8.96）分]相比,酒依赖病例组MQ[（50.59±8.64）分]显著低于正常对照组（t=-6.08,P＜0.01）.与对照组NR2B表达水平（1.00±0.00）相比,酒依赖病例组NR2B表达水平（3.52±1.17）升高,差异具有统计学意义（t=9.67,P＜0.01）.酒依赖患者组MQ与NR2B表达水平呈负相关（r=-0.44,P＜0.05）.结论酒依赖患者存在记忆损害,调节NR2B表达水平可能改善酒依赖患者记忆功能.

关键词：酒依赖记忆损害 N-甲基-D天冬氨酸2B受体

miR-425-5p通过调控靶基因HGF促进急性心肌梗死诱导心肌纤维化的分析

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临床与实验病理学杂志 2019年第4期35卷 425-429页

作者：郭义威陶晶王志勇河南省新乡医学院人体解剖学教研室新乡453003

目的探讨miR-425-5p与肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的相关性,并分析两者的调控作用影响急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)进程诱导心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)的发生。方法采用qRT-PCR检测miR-425-5p在AMI患者及AMI小鼠中的表达水平;荧光素酶报告基因法分析HGF及Western blot检测HGF与miR-425-5p的相关性;应用CCK8和流式细胞法分别检测miR-425-5p转染后对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖能力的影响;通过心脏超声心动图检测AMI小鼠心肌注射miR-425-5p mimics慢病毒4周后的左室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF);采用qRT-PCR检测心肌注射miR-425-5p mimics慢病毒的AMI小鼠中Nppa mRNA的表达量;通过Masson’s trichrome染色法检测小鼠4周后左心室纤维化;应用CD31抗体对小鼠左室切片进行免疫组化分析; ELISA检测AMI小鼠心脏中miR-425-5p与HGF的蛋白表达量。结果 miR-425-5p与AMI存在相关调控机制; miR-425-5p可下调HGF的mRNA和蛋白表达,而miR-425-5p inhibitor可抑制该下调; miR-425-5p可抑制细胞的增殖;与心肌注射miR-425-5p mimics慢病毒的AMI小鼠相比,AMI小鼠的左心室纤维化增加; miR-425-5p可促进心肌梗死的发展; miR-425-5p过表达的AMI小鼠心脏中CD31阳性毛细血管的数量明显低于AMI小鼠; miR-425-5p能通过抑制HGF的表达导致AMI小鼠心脏中血管的生成受到抑制,导致心功能降低。结论 miR-425-5p通过抑制HGF的表达,显著促进AMI诱导MF的病理进程。

关键词：急性心肌梗死心肌纤维化 miR-425-5p HGF