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2型猪链球菌SSU05_0736基因敲除株的构建及其特性分析

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医学研究生学报 2016年第6期29卷 571-576页

作者：钟璟皓胡丹唐慧娴王依钱思彤龚秀芳潘秀珍王长军姚文兵中国药科大学生命科学与技术学院南京药学硕士研究生210009 南京军区军事医学研究所南京210002

目的 2型猪链球菌是重要的人畜共患病病原菌,鉴定现有的和发掘新的毒力因子依然是该领域的研究热点。探讨SSU05_0736编码的c AMP受体蛋白在2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,*** 2)中国强毒株05ZYH33中的作用机制,初步分析SSU... 详细信息

目的 2型猪链球菌是重要的人畜共患病病原菌,鉴定现有的和发掘新的毒力因子依然是该领域的研究热点。探讨SSU05_0736编码的c AMP受体蛋白在2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,*** 2)中国强毒株05ZYH33中的作用机制,初步分析SSU05_0736基因敲除株的生物学特性,为进一步研究猪链球菌可能的毒力因子及其致病机制提供研究基础。方法利用同源重组原理构建并筛选由壮观霉素抗性基因(Spcr)替换*** 2中SSU05_0736的基因敲除株Δ0736,系统比较分析野毒株与敲除株的生物学特性,同时将BALB/c小鼠作为动物感染模型来探究敲除株的毒力。结果通过组合PCR、反转录PCR(RT-PCR)等方法鉴定并成功构建基因敲除株Δ0736,其在菌落形态、溶血活性及对小鼠致病力等方面与野毒株无显著差异;两者生长速率相比,敲除株的生长较野毒株迟缓但其在对数期增长速率较大。结论 SSU05_0736基因的缺失并未使猪链球菌2型强毒株05ZYH33的毒力发生显著改变,推测SSU05_0736基因并非毒力决定因子,但与野毒株相比敲除株在生长速率尤其对数期增长速率较大这一方面的改变,提示可对其代谢调控能力作进一步分析。

关键词：猪链球菌2型基因敲除突变株 cAMP受体蛋白

2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株的构建

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中国病原生物学杂志 2022年第7期17卷 770-773,778页

作者：王悄悄郑峰刘旭苗林苗倪华王怡雯曹祥荣汪春晖潘秀珍东部战区疾病预防控制中心江苏南京210002 南京师范大学生命科学学院新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室喀什大学生命与地理科学学院

目的构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05_0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶... 详细信息

目的构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05_0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶切后连接至猪链球菌-大肠埃希菌穿梭质粒pSET2,构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C。将pSET2::P0530cps2C电转化导入*** 2野生毒株05ZYH33感受态细胞,抗性及组合PCR筛选得到cps2C过表达株。qRT-PCR检测过表达株cps2C基因的转录水平。结果重叠延伸PCR成功将P0530启动子片段(300 bp)和cps2C基因片段(696 bp)拼接为P0530cps2C(996 bp),片段及载体经BamH I和EcoR I酶切后连接,成功构建出过表达质粒pSET2::P0530cps2C;将pSET2::P0530cps2C电转化导入*** 205ZYH33感受态细胞,抗性筛选及组合PCR检测结果显示cps2C过表达株构建成功。提取野生株05ZYH33和cps2C过表达株总RNA后进行qRT-PCR实验,结果显示过表达株cps2C基因的相对表达水平较05ZYH33株上调2.4倍。结论本研究选用*** 205ZYH33的延伸因子TufA强启动子P0530作为启动子,成功构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C并导入*** 2感受态细胞,成功获得cps2C过表达株,为进一步研究酪氨酸激酶Cps2C功能提供实验材料。

关键词： 2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C 过表达株

2型猪链球菌二元信号系统孤儿调控因子CovR磷酸化位点鉴定

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中国人兽共患病学报 2021年第5期37卷 392-397页

作者：王悄悄李超龙张会芳刘旭苗郑峰汪春晖潘秀珍曹祥荣南京师范大学生命科学学院南京210023 东部战区疾病预防控制中心南京210002

目的利用Escherichia coli BL21原核表达系统共表达2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶STK与孤儿调控因子CovR蛋白,通过质谱鉴定CovR蛋白磷酸化位点,探究STK对CovR的磷酸化作用。方法构建CovR蛋白表达载体pCDFDuet-1::covR及pCDFDuet-1::covR... 详细信息

目的利用Escherichia coli BL21原核表达系统共表达2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶STK与孤儿调控因子CovR蛋白,通过质谱鉴定CovR蛋白磷酸化位点,探究STK对CovR的磷酸化作用。方法构建CovR蛋白表达载体pCDFDuet-1::covR及pCDFDuet-1::covR/stk,重组表达蛋白分别命名为CovR1与CovR2。通过蛋白磷酸化质谱技术检验CovR2蛋白的关键磷酸化位点。分别构建CovR苏氨酸突变体CovRT、丝氨酸突变体CovRS、酪氨酸突变体CovRY及丝/苏/酪氨酸全突变体CovRA,与STK共表达后分析其磷酸化状态,确定CovR磷酸化靶点。结果在*** BL21表达系统中成功表达并纯化CovR1与CovR2蛋白,Western blot分析发现CovR1无磷酸化信号,CovR2可以被磷酸化。进一步对CovR2磷酸化质谱检测发现其第45、148、150、159、168、194、219位苏氨酸,第40、172、215位丝氨酸以及第225位酪氨酸为关键磷酸化位点。对CovRT、CovRS、CovRY及CovRA突变体磷酸化状态检测,结果表明CovR2的丝/苏/酪氨酸均可发生磷酸化。结论在*** BL21中共表达STK与CovR可导致CovR丝/苏/酪氨酸磷酸化,通过质谱技术鉴定了CovR的磷酸化位点,提示CovR可能是STK的磷酸化调控靶点。

关键词： 2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶孤儿调控因子CovR 磷酸化检测

2型猪链球菌低分子量酪氨酸磷酸酶的制备及酶学研究

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中国人兽共患病学报 2018年第7期34卷 588-594页

作者：吴倩倩潘秀珍李超龙侯红芬王长军高基民温州医科大学检验医学院生命科学学院温州325000 南京军事医学研究所南京210002

目的表达纯化2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)低分子量酪氨酸磷酸酶(Low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP),测定LMW-PTP磷酸酶活性并鉴定其酶活性位点,为后续的功能鉴定奠定基础。方法分别构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMWPTPC33A和pET28a:LMW-PTPR39A,重组质粒转化*** BL21(DE3),筛选阳性转化子,通过IPTG诱导表达后经SDS-PAGE鉴定表达产物。镍柱亲和层析纯化得到重组蛋白经Western blot鉴定,野生型LMW-PTP免疫新西兰兔制备兔多克隆抗体。以对硝基苯酚二钠六水(PNPP-Na)为底物检测重组蛋白的磷酸酶活性。结果成功构建野生型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTP、突变型LMW-PTP基因表达质粒pET28a:LMW-PTPC33A、pET28a:LMW-PTPR39A,在大肠杆菌中野生型和突变型LMW-PTP均以包涵体的形式存在,相对分子量为23kDa,包涵体经镍柱纯化及透析复性获得纯度较高的野生型和突变型LMW-PTP。制备得到的抗LMW-PTP的兔多克隆抗体的效价为1∶102 400,且重组蛋白均能与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应。对野生型蛋白进行磷酸酶活性检测显示其具有酶活性,酶活为2.1nmol/(min·μg),突变型LMW-PTPC33A、LMW-PTPR39A无磷酸酶活性。结论成功表达了具有磷酸酶活性的LMW-PTP,并鉴定出Cys33和Arg39是LMW-PTP的活性位点。为后续寻找LMW-PTP在2型猪链球菌致病过程中毒力相关的靶蛋白奠定了基础。

关键词： 2型楮链球菌低兮子量酪氧酸磷酸酶原梭表达

2型猪链球菌中国强毒株及其covR基因突变株的蛋白质组学研究

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中国人兽共患病学报 2016年第5期32卷 417-423页

作者：倪华张剑郑峰胡丹李先富王长军潘秀珍南京师范大学生命科学学院南京210023 南京军区军事医学研究所南京210002

目的通过比较2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33及其covR基因突变株△covR蛋白表达谱差异,质谱鉴定差异表达蛋白,分析CovR在蛋白表达调控中的作用。方法首先将05ZYH33和△covR在THB培养基中培养至对数期,然后裂解细菌制备蛋白样品。第一向... 详细信息

目的通过比较2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33及其covR基因突变株△covR蛋白表达谱差异,质谱鉴定差异表达蛋白,分析CovR在蛋白表达调控中的作用。方法首先将05ZYH33和△covR在THB培养基中培养至对数期,然后裂解细菌制备蛋白样品。第一向等电聚焦电泳在pH3～10的IPG胶条上完成后进行SDS-PAGE电泳,电泳胶经扫描分析后选取蛋白点进行质谱鉴定。结果 05ZYH33和△covR全菌蛋白裂解液经二维电泳分别得到559和491个蛋白点,经比对发现两菌株蛋白表达量差异3倍以上蛋白点40个,经质谱鉴定出15个蛋白,主要涉及细胞代谢的酶类如谷氨酸脱氢酶、腺苷酸激酶、PTS系统成分等,以及分子伴侣蛋白如GroEL和Dnak等;电泳分离得到△covR特异蛋白点124个,质谱鉴定出15个,主要为参与细胞糖代谢过程中的酶,如磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶等;质谱鉴定05ZYH33特异表达蛋白5个。结论鉴定05ZYH33和△covR差异表达蛋白35个,部分蛋白涉及细菌毒力、宿主细胞粘附、细胞分裂等生命过程,同时蛋白分子伴侣在△covR中的表达变化说明CovR的调控可能发生在蛋白修饰水平,为研究CovR在调控细菌毒力中的作用和分子机制奠定基础。

关键词： 2型猪链球菌毒力调控因子CovR 二维电泳蛋白质组

2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定

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中国人兽共患病学报 2017年第3期33卷 250-255页

作者：范伟伟倪华孙卫平张剑李超龙吴倩倩王长军潘秀珍中国药科大学中药学院南京211198 南京军区军事医学研究所南京210002

目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ft... 详细信息

目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ftsz,转化*** BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,Ni 2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA法检测抗体效价,用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒;纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白;ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200;Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应;以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。

关键词： 2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白纯化

2型猪链球菌细胞分裂蛋白GpsB的原核表达及其鉴定

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中国人兽共患病学报 2019年第3期35卷 201-205页

作者：侯红芬张会芳胡丹郑峰朱旭辉王长军潘秀珍曹祥荣南京师范大学生命科学学院南京210046 南京军事医学研究所南京210002

目的利用原核表达系统诱导表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,*** 2)分裂相关因子GpsB重组蛋白,为后续研究奠定基础。方法以*** 2菌株05ZYH33全基因组DNA为模板,经PCR扩增得到目的基因片段。目的基因经双酶切后连接至表达载体pET32a... 详细信息

目的利用原核表达系统诱导表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,*** 2)分裂相关因子GpsB重组蛋白,为后续研究奠定基础。方法以*** 2菌株05ZYH33全基因组DNA为模板,经PCR扩增得到目的基因片段。目的基因经双酶切后连接至表达载体pET32a,转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)DH5α感受态细胞。重组质粒经测序鉴定正确后转化*** BL21感受态细胞。获得的重组表达菌经IPTG诱导表达目的蛋白。利用Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。利用重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果成功构建出重组表达载体pET32a^(gpsB),并经IPTG诱导表达出目的蛋白。重组蛋白主要存在于表达菌裂解液上清中,分子质量约30 kD,与预期大小一致。Western blot检测发现,该蛋白能被His-Tag单克隆抗体特异性识别。制备的多克隆抗体能特异性识别重组GpsB蛋白(rGpsB)。结论成功表达和纯化了rGpsB并获得了该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在*** 2分裂过程中的作用鉴定了基础。

关键词： 2型猪链球菌 GpsB 原核表达多克隆抗体

2型猪链球菌天冬氨酸激酶的原核表达及抗原性检测

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中国病原生物学杂志 2017年第4期12卷 302-305页

作者：孙卫平吴倩倩范伟伟张剑李超龙王长军潘秀珍高基民温州医科大学检验医学院生命科学学院浙江温州325000 南京军区军事医学研究所江苏南京210002

目的原核表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)并检测其免疫原性。方法对*** 2中国强毒株05ZYH33的AK编码基因05SSU1811进行生物信息学分析并设计引物,通过PCR从05ZYH33基因组中扩增目的片段。将目的... 详细信息

目的原核表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)并检测其免疫原性。方法对*** 2中国强毒株05ZYH33的AK编码基因05SSU1811进行生物信息学分析并设计引物,通过PCR从05ZYH33基因组中扩增目的片段。将目的基因克隆入原核表达载体pET28a,转化*** BL21(DE3)后采用IPTG诱导表达目的蛋白,用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的重组AK免疫BALB/c小鼠4次,采血,分离血清,采用间接ELISA检测抗体效价,并进行Western blot分析。结果构建的重组质粒在宿主菌中高效表达目的蛋白,His亲和层析柱纯化的重组蛋白,能与感染05ZYH33全菌的猪恢复期血清反应。ELISA检测重组AK免疫鼠血清抗体效价为1∶102 400,Western blot显示该抗血清能与重组蛋白反应。结论成功制备重组AK蛋白,该蛋白具有抗原性,为进一步研究AK在*** 2致病过程中的作用奠定了基础。

关键词： 2型猪链球菌原核表达天冬氨酸激酶多克隆抗体

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA的原核表达及纯化

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中国病原生物学杂志 2016年第6期11卷 500-504,508页

作者：倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军曹祥荣潘秀珍南京军区军事医学研究所江苏南京210000 南京师范大学江苏南京210046

目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接... 详细信息

目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接至表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-divIVA,经测序鉴定后将重组质粒转化进入表达菌*** BL21,以终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃培养4h,诱导DivIVA蛋白表达。用Ni离子亲和层析柱分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建重组表达质粒pET28a-divIVA,并在*** BL21中表达主要以包涵体形式存在的DivIVA蛋白。包涵体蛋白经8mol/L脲变性溶解后经Ni离子亲和层析柱纯化,获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测分子质量为36ku,与预期大小相符;经Western blot检测,该蛋白能被相应抗体特异性识别。结论在*** BL21中成功表达并纯化了DivIVA蛋白,为研究该蛋白在2型猪链球菌的细胞分裂机制奠定了基础。

关键词： 2型猪链球菌 DivIVA蛋白蛋白原核表达