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鸡Stra8基因真核表达载体构建及亚细胞定位的研究

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中国家禽 2013年第8期35卷 10-13页

作者：王丹张振韬施青青黄晓梅朱才业郑蒙蒙李伟徐剑蓉王克华李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 扬州市邗江区畜牧兽医站江苏扬州225002 中国农业科学院家禽研究所江苏扬州225125

试验旨在克隆苏禽黄鸡视黄酸激活基因8(Stra8)的cDNA序列,构建pEGFP-C1-Stra8载体并制备鸡Stra8抗体。通过RT-PCR克隆苏禽黄鸡Stra8基因cDNA,构建pEGFP-C1-Stra8和pcDNA3.1(+)-Stra8重组质粒,分别转染NIH-3T3细胞和免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光法检测抗体效价以及在细胞中的分布。结果显示,苏禽黄鸡Stra8基因cDNA全长645bp,共编码214个氨基酸,提交至GenBank获得登录号为JX204292.1;成功制备Stra8多克隆抗体,pEGFP-C1-Stra8融合蛋白在NIH-3T3细胞质中表达。该结果为深入探讨禽类Stra8生物学功能奠定了基础。

关键词： Stra8基因质粒DNA免疫多克隆抗体亚细胞定位

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基因组编辑技术的研究进展

畜牧与兽医 2015年第7期47卷 124-129页

作者：李东左其生张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院/江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

随着人类测序技术的发展与成熟,以锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(CRISPR/Cas)为主的基因组编辑技术,在生物、农业、环境及医学等各个领域中发挥着独特的作用。基因... 详细信息

随着人类测序技术的发展与成熟,以锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(CRISPR/Cas)为主的基因组编辑技术,在生物、农业、环境及医学等各个领域中发挥着独特的作用。基因编辑技术主要是通过在外源DNA靶位点上产生双链切口,从而诱导出同源重组修复或非同源末端连接,进而实现基因组的编辑。目前ZFN和TALEN技术被广泛运用,虽然在一定程度上获得明显的效果,但因设计复杂,成本较高,使其运用有所局限。CRISPR/Cas技术近年来凭借其高效、精确的编辑成为最新一代的基因编辑技术。本文就以上3种基因打靶技术的作用原理、应用及优缺点作简单概述,为基因编辑的实践应用提供理论基础。

关键词：基因组编辑 ZFN TALEN CRISPR/Cas

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悬滴培养法促进鸡胚胎干细胞形成类胚体

畜牧兽医学报 2015年第8期46卷 1333-1340页

作者：张蕾王宵燕左其生路镇宇王飞纪艳芹王颖洁张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州225009 江苏农牧科技职业学院泰州225300

本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体(Embryoid body,EB)的最佳方案,以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率。将鸡ESCs培养传代至第3代,采用1×104、3×104和6×104 mL-13个... 详细信息

本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体(Embryoid body,EB)的最佳方案,以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率。将鸡ESCs培养传代至第3代,采用1×104、3×104和6×104 mL-13个细胞浓度,使用悬滴培养后,观察类胚体的形成效率。对悬滴培养形成的类胚体进行形态学观察,qRT-PCR检测干细胞标记基因的表达,免疫细胞化学检测相关蛋白的表达,并进行类胚体自分化检测和核型分析。3×104 mL-1细胞浓度生成的类胚体数量最高,单个视野下可观察到约267个类胚体,且形成的类胚体大小均一,呈圆球状。qRT-PCR检测结果表明,在类胚体形成48h内,干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍维持表达。免疫细胞化学检测显示,该方法形成的类胚体表面抗原检测Nanog和SSEA-1呈阳性。自分化检测三胚层分化标记基因SOX17、SMA和TUJ-1呈阳性。核型分析显示,悬滴培养形成的类胚体具有并保持正常的核型。鸡ESCs悬滴培养形成类胚体的适宜细胞浓度为3×104 mL-1,且形成的类胚体可分化成3个胚层,用于体外定向诱导过程。本研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系,为后期信号通路的体外验证提供试验基础。

关键词：类胚体悬滴培养鸡胚胎干细胞

视黄酸及Stra8基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞分化的影响

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畜牧兽医学报 2014年第1期45卷 38-45页

作者：张振韬王丹施青青 ELSAYED A K 张亚妮韦光辉朱睿左其生李东刘堃李碧春扬州大学动物科学与技术学院扬州225009 College of Veterinary Medicine Suez Canal University

旨在研究视黄酸(All-trans retinoic acid,RA)及Stra8(Stimulated by retinoic acid gene 8)基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs)分化的影响。选用PCR方法鉴定雄性cESCs为研究对象,转染Stra 8基因,对Stra8基因阳性cESCs使用RA进行12d连续诱导,同时设立Stra8基因转染组、RA诱导组及空白组对照,各组均进行3次重复试验。细胞形态学、qRT-PCR检测RA及Sira8基因对cESCs分化的影响。结果表明。转染Stra8基因进行RA诱导,在诱导12d后,出现精原干细胞样的圆形小克隆,其他组cESCs出现类胚体或解体;qRT-PCR鉴定发现各组中干细胞标记基因表达量随着培养时间的延长逐渐下降,同时检测到生殖细胞相关基因表达,转染Stra8基因并使用RA诱导组中表达量均高于对照组(P<0.01),6d表达量达到最高,然后逐渐下降。Stra8基因和RA的联合作用能够促进cESCs向着生殖细胞方向的分化,不仅改变了原有细胞形态,同时出现了生殖相关基因的表达。通过该方法可以在体外建立一个。ESCs诱导分化模型,将为生殖细胞的发生、增殖、分化及调控机理的研究和人类不孕不育症的治疗奠定良好的基础。

关键词： cESCs Stra8基因 RA 联合作用分化基因表达

pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究

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畜牧兽医学报 2014年第8期45卷 1253-1259页

作者：黄晓梅张蕾左其生施青青李东汤贝贝张亚妮宋九州李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室扬州225009 Animal and Avian Science Dept. University of Maryland College Park md20742

本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤... 详细信息

本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)与20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cES:s,添加10μmol·L^(-1)维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cES:s,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP—hTERT转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP—hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>0.05)。综上表明:pEGFP-hTERT转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。

关键词： pEGFP-hTERT hTERT基因 BRL-CM 鸡胚胎干细胞

卵泡刺激素诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

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中国家禽 2014年第13期36卷 10-15页

作者：蒋一秀许厚强左其生张蕾李东施青青张亚妮李碧春贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵州贵阳550025 扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫... 详细信息

文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。筛选出适宜的FSH浓度为25 ng/mL。单独使用FSH诱导,未出现类SSCs样细胞;FSH与支持细胞诱导至第6天出现类胚体,至第12天,出现少量精原样细胞;FSH联合支持细胞和维甲酸(RA)进行诱导,至第2天出现类胚体,第12天出现类SSC样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,FSH+支持细胞组、FSH+支持细胞+RA组中,Stra8、integrinβ1、Dazl表达量都持续上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势。添加FSH的诱导组中Stra8的表达量相对于各对照组上调显著。FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但具有促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。

关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化卵泡刺激素

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CRISPR-Cas介导的基因编辑工具

生物技术通报 2014年第7期30卷 37-43页

作者：左其生李东张亚妮李碧春扬州大学动物科学技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室扬州225009

近年来,随着人们对CRISPR-Cas系统研究的不断深入和改造,CRISPR-Cas系统已成为一项新的基因靶向修饰技术,能够定向对靶基因进行定向沉默,目前该项技术已经成功地用于HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株,在小鼠、... 详细信息

近年来,随着人们对CRISPR-Cas系统研究的不断深入和改造,CRISPR-Cas系统已成为一项新的基因靶向修饰技术,能够定向对靶基因进行定向沉默,目前该项技术已经成功地用于HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株,在小鼠、果蝇等模式动物上成功构建了基因敲除模型。CRISPR-Cas以其设计简单,耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔应用前景的基因靶向敲除技术。就CRISPR-Cas的发现、结构、作用机理以及Cas9/gRNA目前的一些应用进行综述。

关键词： CRISPR-Cas 基因修饰基因敲除

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性激素促进鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化

中国家禽 2016年第8期38卷 10-16页

作者：张文慧蒋一秀王颖洁左其生李东连超汤贝贝张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

试验分别探讨了睾酮和FSH诱导鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先筛选睾酮和卵泡刺激素(FSH)的适宜诱导浓度,在RA和支持细胞的诱导基础上分别添加适宜浓度的睾酮和FSH对传至2代的ESCs进行诱导... 详细信息

试验分别探讨了睾酮和FSH诱导鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先筛选睾酮和卵泡刺激素(FSH)的适宜诱导浓度,在RA和支持细胞的诱导基础上分别添加适宜浓度的睾酮和FSH对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。结果显示:睾酮和FSH的适宜诱导浓度分别为15 ng/m L和25 ng/m L,单独使用睾酮和FSH诱导均未出现类SSCs样细胞;二者联合支持细胞和RA诱导,诱导2 d出现类胚体,随后类胚体体积逐渐变大,诱导12 d类胚体解体出现类SSC样细胞;实时荧光定量PCR结果显示,睾酮和FSH分别与支持细胞和RA共同诱导组中,Stra8表达量持续上调,integrinβ1、Dazl表达量显著上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下降趋势;睾酮的多因素诱导组中,Dazl的表达量明显高于RA和支持细胞诱导组;而FSH的多因素诱导组中Stra8的表达量相对于RA和支持细胞诱导组也显著升高。结果表明睾酮和FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但可以促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。

关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化睾酮卵泡刺激素

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鸡蛋开窗法对嵌合体鸡制备效率的影响

中国家禽 2015年第12期37卷 5-8页

作者：王颖洁张文慧左其生李东张蕾汤贝贝连超肖天荣张亚妮李碧春扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物繁育与分子设计重点实验室江苏扬州225009

将受体种蛋分为3组,分别经换壳法、钝端开窗法和赤道面开窗后,比较3种开窗方法对孵化率的影响;分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后用线性化的质粒p EGFP-N1转染鸡ESCs,比较显微注射时3种不同的处理方法对孵化率的影响;对获得的... 详细信息

将受体种蛋分为3组,分别经换壳法、钝端开窗法和赤道面开窗后,比较3种开窗方法对孵化率的影响;分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后用线性化的质粒p EGFP-N1转染鸡ESCs,比较显微注射时3种不同的处理方法对孵化率的影响;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:赤道面开窗法的孵化率显著高于换壳法和钝端开窗法(P<0.01);开窗后,显微注射经转染的ESCs组孵化率显著低于其他2组(P<0.01);PCR检测结果显示,有四只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中两只鸡的性腺发生EGFP基因的嵌合。表明赤道面开窗后,对受体鸡胚下腔显微注射经转染的ESCs可以生产嵌合体鸡,产生嵌合体鸡的效率为4.17%。

关键词：开窗法显微注射嵌合体鸡