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小花棘豆(Oxytropis glabra DC)内生真菌的分布特点

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微生物学报 2013年第5期53卷 478-485页

作者：周启武路浩何平严杜建赵宝玉张樑温伟利杨晓雯西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 阿克苏职业技术学院阿克苏843000

【目的】为探明小花棘豆不同组织中内生真菌带菌率及其种属分布特点,对采自内蒙古阿拉善盟草原的小花棘豆各组织内生真菌进行检测与分离。【方法】制作小花棘豆不同组织临时装片,通过染色观察与分离鉴定方法研究小花棘豆各组织中内生真... 详细信息

【目的】为探明小花棘豆不同组织中内生真菌带菌率及其种属分布特点,对采自内蒙古阿拉善盟草原的小花棘豆各组织内生真菌进行检测与分离。【方法】制作小花棘豆不同组织临时装片,通过染色观察与分离鉴定方法研究小花棘豆各组织中内生真菌分布形态、带菌率以及内生真菌种属分布情况。【结果】通过临时装片染色技术从小花棘豆茎、叶、叶柄及种子中均检测到内生真菌并观察到其在各组织中的分布特点;采用普通分离方法从小花棘豆四种组织中分离出79株内生真菌,鉴定为5个种。比较小花棘豆各组织内生真菌带菌率与分离率发现种子>叶>茎>叶柄,且小花棘豆内生真菌的主要优势种(相对分离频率)为疯草内内生真菌(Undifilum oxytropis)(77.32%),砖格孢属(Embellisia sp.)L12(64.00%),镰刀菌属(Fusariumequiseti)(50.00%)。【结论】小花棘豆各组织中普遍存在内生真菌,其在各组织中的形态分布各异,内生真菌数量与种属分布存在组织差异性,种子和叶是内生真菌侵染和定殖的主要部位。

关键词：小花棘豆内生真菌检测分离鉴定分布特点

小花棘豆和变异黄芪内生真菌显微分布及定量检测

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微生物学报 2014年第5期54卷 572-581页

作者：周启武于龙凤路浩曹丹丹赵宝玉临沧师范高等专科学校农学系云南临沧677000 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

【目的】了解内蒙古阿拉善和宁夏天然草原的小花棘豆和变异黄芪不同组织中内生真菌Undifilum oxytropis的显微分布特点和含量分布规律。【方法】通过石蜡切片结合乳酸酚棉蓝染色法观察,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行定量研究,获得... 详细信息

【目的】了解内蒙古阿拉善和宁夏天然草原的小花棘豆和变异黄芪不同组织中内生真菌Undifilum oxytropis的显微分布特点和含量分布规律。【方法】通过石蜡切片结合乳酸酚棉蓝染色法观察,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行定量研究,获得各组织(茎、叶、种子和根)中内生真菌分布和含量。【结果】种子中内生真菌主要定殖于种皮栅栏组织与薄壁组织两层的细胞间隙;叶片组织主要定殖于靠近气孔的表皮细胞层,茎髓中内生真菌围绕于茎髓质维管束纵轴边缘的薄壁细胞层中;RT-qPCR的检测限为0.029 pg/ng总DNA,各采样点相应组织内生真菌含量不同,两采样点小花棘豆种子中***含量均为最高,叶和茎相反,两地变异黄芪为种子中最高,根最低,叶和茎相反。【结论】内生真菌寄生在植物组织时对宿主组织和细胞类型均有选择性,生境对疯草中内生真菌的定殖和分布也有影响。

关键词：小花棘豆变异黄芪疯草内生真菌显微分布荧光定量PCR

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茎直黄芪内生真菌分离鉴定及其多样性分析

草地学报 2015年第6期23卷 1252-1258页

作者：曹丹丹路浩李小蒙郭亚洲薛瑞旭王欢权海云赵宝玉西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为探明茎直黄芪(Astragalus strictus)不同组织部位内生真菌种群分布及其物种多样性,对采自西藏工布江达县的茎直黄芪样品,运用形态学和rDNA-ITS序列分析技术鉴定其种属,并计算多样性指数。结果表明:从茎直黄芪424个组织块中分离到内生... 详细信息

为探明茎直黄芪(Astragalus strictus)不同组织部位内生真菌种群分布及其物种多样性,对采自西藏工布江达县的茎直黄芪样品,运用形态学和rDNA-ITS序列分析技术鉴定其种属,并计算多样性指数。结果表明:从茎直黄芪424个组织块中分离到内生真菌336株,分属7纲、9目、10科、13属,其中Alternaria tenuissima分离率最高为32.14%,是优势种属,其次是Undifilum oxytropis,分离率为19.05%;多样性指数显示,茎直黄芪不同组织部位内生真菌多样性指数不同,花中内生真菌香农-维纳指数(2.16)及辛普森指数(0.154)及均匀度指数(0.80)均最高,表明其多样性最高,叶次之,茎最低。表明茎直黄芪不同组织内生真菌的数量、种属组成及多样性存在明显差异,花是内生真菌定植的主要部位,且其多样性最高。

关键词：茎直黄芪内生真菌分离鉴定物种多样性

中国西部天然草地疯草生态及动物疯草中毒研究与防控现状

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中国农业科学 2013年第6期46卷 1280-1296页

作者：周启武赵宝玉路浩王姗姗张樑温伟利杨晓雯西北农林科技大学动物医学院

西部天然草地是中国草地畜牧业的重要生产基地,也是其重要的绿色生态屏障,对维护生态安全和食物安全,保护人类生存环境,实现草地永续利用,具有重要战略意义。长期以来,由于草地干旱、超载过牧、盲目开垦等自然和人为因素的影响,以及草... 详细信息

西部天然草地是中国草地畜牧业的重要生产基地,也是其重要的绿色生态屏障,对维护生态安全和食物安全,保护人类生存环境,实现草地永续利用,具有重要战略意义。长期以来,由于草地干旱、超载过牧、盲目开垦等自然和人为因素的影响,以及草地基础建设投入不足和管理滞后,导致草地大面积沙化和毒草化。特别是近几十年来,草地毒害草的迅速蔓延,造成草地植被群落和生物多样性减少,草地植被单一,沙漠化等生态学问题,严重影响了草地生态平衡以及牧区畜牧业的可持续发展。"疯草"已成为西部天然草地主要毒害草之首,每年给畜牧业造成直接经济损失超过几十亿元。本文就中国西部天然草地疯草研究历史、种类与生态分布、毒性灾害状况、毒性成分与毒性机理、灾害及综合防控技术进行综述,并提出今后疯草研究中应注意的问题,对认识疯草在天然草地中的生态作用和疯草灾害综合防控具有重要指导意义。

关键词：天然草地疯草中毒毒性灾害防控

金龟子绿僵菌合成苦马豆素SwnR基因功能研究

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金龟子绿僵菌合成苦马豆素SwnR基因功能研究

作者：宋润杰西北农林科技大学

学位级别：硕士

目前研究表明,疯草类有毒植物的毒性成分-苦马豆素(Swainsonine)主要由三类真菌产生,即豆类丝核菌(Rhizocronia leguminicola)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和棘豆蠕孢菌(Alternaria oxytropis),而有关苦马豆素生物合成通路... 详细信息

目前研究表明,疯草类有毒植物的毒性成分-苦马豆素(Swainsonine)主要由三类真菌产生,即豆类丝核菌(Rhizocronia leguminicola)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和棘豆蠕孢菌(Alternaria oxytropis),而有关苦马豆素生物合成通路及催化酶基因尚不清楚。鉴于此,本试验以金龟子绿僵菌为研究对象,通过PEG介导的方法对金龟子绿僵菌合成苦马豆素疑似催化酶基因SwnR进行敲除并验证其功能,旨在探讨SwnR基因在金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路中的作用,为深入研究苦马豆素生物合成通路及相关催化酶基因奠定理论基础。试验结果如下:1.根据GeneBank上的标准序列设计SwnR基因引物,以金龟子绿僵菌cDNA为模板,高保真扩增SwnR基因,PCR产物测序结果与SwnR基因序列BLAST比对同源性为99%。2.以pUC19载体为骨架,通过无缝克隆的方法构建含有苯菌灵抗性基因的金龟子绿僵菌SwnR基因的敲除载体,SwnR上游基因序列和下游基因序列分别连在苯菌灵抗性基因的两端。经PCR和测序鉴定,成功构建载体。3.选用不同发酵时间的金龟子绿僵菌菌丝,在不同的酶解组合及不同酶解时间下对金龟子绿僵菌原生质体的制备条件进行筛选。结果显示,金龟子绿僵菌在CS培养基震荡培养3d,菌丝由1%纤维素酶、1%蜗牛酶和0.5%溶壁酶处理并放置于30℃100rpm孵育3h,原生质体制备效果最佳。4.通过PCR将同源片段进行扩增后,利用PEG转化法将纯化后的片段转化至原生质体。再经苯菌灵筛选获得SwnR基因突变菌株,提取突变菌株DNA并进行PCR验证,SwnR基因敲除菌株构建成功。5.将上述试验获得的突变型与野生型菌株进行发酵培养,经Q Exactive高分辨质谱仪检测野生型与突变型菌株发酵液中苦马豆素的含量分别为119.652μg/mg和11.831μg/mg;采用RT-qPCR技术分析后,发现突变型菌株SwnR基因表达显著下调。本研究成功获得了金龟子绿僵菌SwnR基因敲除菌株,并证明SwnR基因在金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路中起重要调控作用,这为后续SwnR基因在疯草棘豆蠕孢菌苦马豆素合成中的作用及家畜疯草中毒病防控研究提供重要理论参考。

关键词：疯草金龟子绿僵菌 SwnR基因苦马豆素基因敲除

不同培养温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响

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中国兽医杂志 2016年第12期52卷 41-44页

作者：曹丹丹路浩薛瑞旭王欢权海云赵宝玉西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 江苏省泰州市高港区农业委员会江苏高港225300

为了探讨温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响。对采集于内蒙古腾格里变异黄芪的茎、叶和花,运用表面消毒法和尖端菌丝挑取法将组织块分别置于20℃、28℃和室温(变温)条件下进行内生真菌分离与纯化,采用形态学和ITS序列分析技术进行种... 详细信息

为了探讨温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响。对采集于内蒙古腾格里变异黄芪的茎、叶和花,运用表面消毒法和尖端菌丝挑取法将组织块分别置于20℃、28℃和室温(变温)条件下进行内生真菌分离与纯化,采用形态学和ITS序列分析技术进行种属鉴定,并计算多样性指数。504块组织块中共分离到内生真菌410株,分属于10科15属23种,不同温度下分离到的内生真菌有所不同,Undifilum oxytropis为优势菌属,且在20℃时优势更为显著。多样性指数计算结果显示,香农-维纳指数(H)为1.85,辛普森指数(D)为0.269,均匀度指数(E)为0.59,不同温度下多样性指数不同,28℃培养香农-维纳指数最高,20℃培养辛普森指数最大。结果表明,温度对内生真菌分离率有一定影响,对Undifilum oxytropis分离率的影响极其显著,而对内生真菌的多样性影响也较为明显。

关键词：变异黄芪温度内生真菌多样性

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变异黄芪内生真菌种群分布特征

畜牧兽医学报 2014年第12期45卷 2057-2066页

作者：曹丹丹路浩赵宝玉薛瑞旭权海云杨晓雯刘晓学严杜建西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 阿克苏职业技术学院阿克苏843000

为探明变异黄芪(Astragalus variabilis)中是否存在内生真菌及其种群分布情况,对采自内蒙古腾格里苏木的变异黄芪样品,采用表面消毒法进行内生真菌分离纯化,并用微生物形态学观察方法和rDNA-ITS序列分析技术对分离获得的内生真菌进行种... 详细信息

为探明变异黄芪(Astragalus variabilis)中是否存在内生真菌及其种群分布情况,对采自内蒙古腾格里苏木的变异黄芪样品,采用表面消毒法进行内生真菌分离纯化,并用微生物形态学观察方法和rDNA-ITS序列分析技术对分离获得的内生真菌进行种属鉴定。结果显示,内蒙古腾格里苏木变异黄芪植株中存在多种内生真菌,在所有不同的消毒时间中,叶的分离率最高(110.00%),花最低(45.00%)。从变异黄芪3种组织中共分离到内生真菌321株,分属于5纲7目11科17属,其中的Undifilum oxytropis分布最广,占总菌株的47.98%,为变异黄芪的优势菌株,其次为炭角菌属(Xylariasp.),其分离率为16.51%。结果表明,变异黄芪内生真菌数量、种属组成与分布存在明显组织差异,叶是内生真菌侵染和定植的主要部位,而茎内生真菌多样性最高。

关键词：变异黄芪内生真菌分离鉴定种群分布

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苦马豆内生真菌分离鉴定与多样性分析

畜牧兽医学报 2013年第3期44卷 465-474页

作者：周启武赵宝玉路浩张潞杨晓雯张樑温伟利西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

为探明苦马豆中是否存在内生真菌及其分布情况,对采自内蒙古阿拉善盟草原的苦马豆样品进行内生真菌分离。通过内生真菌常规分离纯化法分离内生真菌,以确定75%乙醇和2%NaClO的最佳表面消毒时间,并运用形态学方法和rDNA-ITS系列技术对分... 详细信息

为探明苦马豆中是否存在内生真菌及其分布情况,对采自内蒙古阿拉善盟草原的苦马豆样品进行内生真菌分离。通过内生真菌常规分离纯化法分离内生真菌,以确定75%乙醇和2%NaClO的最佳表面消毒时间,并运用形态学方法和rDNA-ITS系列技术对分离菌株进行种属鉴定。结果显示苦马豆叶和种子用75%乙醇及2%Na-ClO的最佳表面消毒时间分别为30s、3.5min和50s、4min。最佳消毒条件下,叶的分离率最高(41.67%),种子次之(37.14%),种子中内生真菌种类与数量比最高(38.75%),其次是茎(20.00%)。从苦马豆的4种组织中共分离得到80株内生真菌,分属于4纲、5目、6科、10属,其中链格孢属(Alternariasp.)和镰刀菌属(Fusariumsp.)的总相对分离率分别为53.75%和21.25%,为苦马豆内生真菌的优势菌属。苦马豆内生真菌的数量、种属组成与分布存在明显组织差异性;其中种子和叶是内生真菌侵染和定植的主要部位,且种子内生真菌多样性最高。

关键词：苦马豆内生真菌分离鉴定 rDNA-ITS 多样性

自噬在苦马豆素致小鼠肾小管上皮细胞毒性损伤中的作用

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自噬在苦马豆素致小鼠肾小管上皮细胞毒性损伤中的作用

作者：王帅西北农林科技大学

学位级别：硕士

“疯草(locoweed)”主要是指豆科黄芪属(Astragalus)和棘豆属(Oxytropis)有毒植物。目前,疯草已成为危害草原畜牧业发展的主要毒草,且广泛分布于世界各地。据统计,在美国和中国,每年的经济损失高达2000万～1亿美元,严重阻碍畜牧业的可... 详细信息

“疯草(locoweed)”主要是指豆科黄芪属(Astragalus)和棘豆属(Oxytropis)有毒植物。目前,疯草已成为危害草原畜牧业发展的主要毒草,且广泛分布于世界各地。据统计,在美国和中国,每年的经济损失高达2000万～1亿美元,严重阻碍畜牧业的可持续发展。众所周知,疯草的主要毒性成分—苦马豆素(SW)是一种吲哚里西啶类生物碱,其结构与甘露糖高度相似,并且与甘露糖苷酶有极高亲和力,从而竞争性抑制II类α-甘露糖苷酶活性,导致糖代谢紊乱。动物采食后引起的中毒病主要以神经机能紊乱为特征,严重者可导致死亡,病理变化主要表现为广泛的组织细胞空泡变性。自噬是指在外界环境因素影响下,细胞将自身受损、变性、衰老的大分子物质或细胞器,以及侵入体内的病原体运送到溶酶体进行自我消化的生物学过程。有资料显示,当自噬过程发生障碍时往往伴随着空泡样病变。鉴于此,本研究以小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)为试验模型,探讨SW对TCMK-1细胞中自噬相关蛋白表达的影响,阐明自噬在SW致TCMK-1细胞损伤中的调控作用,为进一步阐明疯草中毒机制提供理论依据。试验结果如下:1.苦马豆素诱导TCMK-1细胞发生自噬Western blot检测自噬标志物LC3蛋白表达。用800μg/m L的SW处理不同时间,LC3-II/β-actin比率以时间依赖性方式增加,在12 h表达量最高,且各时间点与对照组之间差异均有统计学意义。随后用不同浓度的SW(0、200、400、800μg/m L)处理细胞12 h,LC3-II/β-actin比率也以剂量依赖性方式增加,且组间差异均有统计学意义。同时,随着剂量的升高,自噬相关蛋白Beclin1表达量也显著升高。DAPI、MDC和LC3-II免疫荧光染色。用不同浓度的SW(0、200、400、800μg/m L)处理细胞12 h,对照组细胞MDC染色呈弥漫性,而处理组细胞出现荧光聚点,表明广泛的MDC阳性自噬泡;LC3-II荧光染色结果显示,SW增加了LC3-II斑点在TCMK-1细胞中的形成,且荧光强度随剂量升高而增强,而对照组不明显。另外,通过透射电镜检测细胞的超微结构,在800μg/m L SW处理的细胞中,可以观察到自噬泡数量明显增多。上述结果表明,SW可诱导大量的自噬泡产生。此外,由于上游自噬体形成增加或下游自噬体降解受阻,LC3-II均可以增加。因此,为了区分这两种可能性,我们使用了自噬抑制剂—氯喹(CQ)。用400μg/m L SW或20μM CQ单独处理以及SW与CQ联合处理细胞,SW与CQ均可以使LC3-II表达显著上升,且联合处理后LC3-II表达呈累加效应,说明SW诱导了自噬。2.苦马豆素导致自噬降解途径受阻p62是连接LC3-II与待降解泛素化底物的桥梁,试验发现p62蛋白表达水平并没有降低,而是随着剂量和时间的增加而增加。另外,RT-PCR试验结果显示LC3-II基因的表达量随剂量的增加显著上升,而p62基因的表达量无变化。p62的积累表明自噬的最终降解可能受阻。自噬降解受阻可能是溶酶体的功能受损,也可能是自噬体与溶酶体融合发生障碍。因此,试验通过激光共聚焦检测LC3-II与溶酶体膜蛋白LAMP-2的共定位来判断自噬体与溶酶体的融合是否受阻。结果显示,对照组无明显的LC3-II及LAMP-2荧光反应,饥饿处理组有明显的LC3-II及LAMP-2荧光反应,且共定位显著,SW处理组也有明显的共定位。但是,通过透射电镜观察空泡样病变时发现,在空泡周围有大量溶酶体聚集,同时还存在少量自噬体,说明可能是溶酶体降解功能受损导致自噬降解受阻。***3K/Akt/m TOR信号通路参与调节苦马豆素诱导的自噬采用Western blot检测自噬信号通路PI3K/Akt/m TOR相关蛋白的表达。用不同浓度SW处理TCMK-1细胞,随着SW浓度的增加,p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达水平显著下降,而总的PI3K、Akt、m TOR保持不变。此外,试验还对m TOR下游p70S6K、4EBP1的激活状态进行了检测,p-p70S6K、p-4EBP1蛋白表达量也显著降低,而总的p70S6K、4EBP1保持不变。以上研究结果表明,自噬信号通路PI3K/Akt/m TOR参与SW诱导的TCMK-1细胞自噬。上述结果表明,苦马豆素可以诱导TCMK-1细胞发生自噬,同时引起自噬降解阶段发生障碍,但不影响自噬体与溶酶体的融合,说明自噬降解障碍可能与溶酶体功能受损有关。此外,PI3K/Akt/m TOR信号通路参与调控苦马豆素诱导的细胞自噬。该项研究为深入探讨苦马豆素毒性作用机制提供一定的理论依据。

关键词：疯草苦马豆素自噬小鼠肾小管上皮细胞 PI3K/Akt/mTOR通路空泡变性