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鳜弹状病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

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水产科学 2024年第2期43卷 281-288页

作者：张彦冰叶加鑫孙威刘晓丹林强中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009

近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入... 详细信息

近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入杆状病毒穿梭载体pFastBac1中转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,筛选阳性克隆获得重组转移载体pFastBac-G,再将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑与抗性筛选后获取重组杆粒rBacmid-G,随后利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒。将获取到的P3代重组病毒感染Sf9昆虫细胞进行重组蛋白的SDS-PAGE检测,成功表达后利用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,随后对重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示在大于50 ku处有一条特异性条带,而对照组无条带,表明制备的抗原能与抗体特异性结合。结果表明,鳜弹状病毒糖蛋白G在杆状病毒表达系统成功表达。本试验结果可为鳜弹状病毒糖蛋白G疫苗的研发和大规模生产提供技术支撑。

关键词：鳜弹状病毒糖蛋白杆状病毒表达系统重组杆状病毒

阿维菌素对中华绒螯蟹肝胰腺氧化胁迫效应和组织结构的影响

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生态毒理学报 2017年第4期12卷 337-347页

作者：杨宗英杨移斌张一柳胡鲲曾柳根刘力硕闫子君杨先乐常藕琴上海海洋大学国家水生动物病原库上海201306 南昌市农业科学院南昌330038 中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223 农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所广州510380

采用半静态染毒法,研究不同浓度(1.6、8.0、16.0μg·L-1)阿维菌素在胁迫中华绒螯蟹12、24、48、96 h时肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)积累量等氧化胁迫相关指标的变化;并在胁迫60 d时,记录各实验组和对... 详细信息

采用半静态染毒法,研究不同浓度(1.6、8.0、16.0μg·L-1)阿维菌素在胁迫中华绒螯蟹12、24、48、96 h时肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)积累量等氧化胁迫相关指标的变化;并在胁迫60 d时,记录各实验组和对照组中华绒螯蟹肝胰腺颜色的变化并进行组织病理观察。3个阿维菌素浓度组为实验组,空白组和溶剂组为对照组。结果表明在整个实验过程中空白组和溶剂组各个时间点各项指标之间无显著差异(P>0.05);低浓度(1.6μg·L-1)组SOD和CAT活力变化不显著(P>0.05);中浓度(8.0μg·L-1)组SOD和CAT活力变化趋势一致,持续被诱导,SOD活力在24 h以后显著高于空白组(P实验过程中各实验组MDA积累量逐渐增加,高浓度组氧化胁迫指标的变化幅度大于低浓度组。胁迫60 d时,取样观察可见对照组中华绒螯蟹肝胰腺正常,各实验组中华绒螯蟹肝胰腺发生了不同程度的病变,肝胰腺颜色由最开始的橘黄色变成了淡黄色、黄白色甚至白色,高、中、低各浓度组肝胰腺白化所占的比例分别是66.6%、57.1%和25.0%。组织病理分析显示,淡黄色肝胰腺的病理变化主要是B细胞数量减少,肝胰腺上皮细胞部分肿大并出现空泡;黄白肝病理观察可见肝胰腺上皮细胞中空泡数量增多,体积增大,且空泡内出现内容物,细胞核固缩;白肝的病理表现主要是基膜增厚,上皮细胞大量脱落,散落在管腔中,空泡数量进一步增多,肝胰腺的生理功能受损。由此得出,阿维菌素会对中华绒螯蟹肝胰腺造成氧化胁迫和组织损伤,且阿维菌素和对肝胰腺的氧化胁迫效应和组织结构损伤程度有一定的剂量-效应关系。

关键词：阿维菌素中华绒螯蟹氧化胁迫指标肝胰腺组织结构

中华鲟ASDIGIRR与ASTRAF6基因的克隆与表达

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水产学报 2021年第8期45卷 1296-1306页

作者：张利凤汤东东郑楚文邓丹郭慧芝张书环张文兵许巧情李宁求长江大学动物科学学院中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室贵州中医药大学基础医学院

中华鲟是处在硬骨鱼类与软骨鱼类之间的中国古老的珍稀鱼类之一,但在人工繁殖和养殖过程中,容易受到不同疾病的危害,因此,需要深入研究其免疫调控,为其疾病预防提供理论依据。单个免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关分子(SIGIRR)和肿瘤坏... 详细信息

中华鲟是处在硬骨鱼类与软骨鱼类之间的中国古老的珍稀鱼类之一,但在人工繁殖和养殖过程中,容易受到不同疾病的危害,因此,需要深入研究其免疫调控,为其疾病预防提供理论依据。单个免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关分子(SIGIRR)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是toll样受体(TLR)信号通路的2个重要的信号转导元件。本研究鉴定了中华鲟的SIGIRR和TRAF6的同源物,分别命名为ASDIGIRR (Acipenser sinensis DIGIRR)和ASTRAF6 (A. sinensis TRAF6),并研究它们在正常组织中的表达和Poly(I:C)诱导后的表达模式。结果显示,ASDIGIRR和ASTRAF6在健康鲟的10个组织中均有表达,且分别在肠道和头肾组织中表达量最高;用Poly (I:C)孵育中华鲟脾脏细胞后,ASDIGIRR在3 h时的表达量显著下调,在6 h时恢复至正常水平,后在24 h显著上调达到最高值,随后开始下调,至48 h时仍显著高于对照组,而ASTRAF6在6 h达到最高表达量,维持到24 h后再下调,48 h时下降至最低水平。研究表明,ASDIGIRR和ASTRAF6在中华鲟抵御病原入侵的免疫防御过程中起着重要作用。

关键词：中华鲟 ASDIGIRR ASTRAF6 Poly (I:C) 基因克隆基因表达

草鱼MyD88基因组结构解析及启动子活性探讨

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水生生物学报 2015年第1期39卷 222-228页

作者：陈晓慧毋凯凯杨春荣付小哲吴淑勤苏建国中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广州510380 西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水经济鱼类,病毒和细菌性疾病对其造成了重大损失[1]。草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病,是对草鱼危害最大的传染性疾病之一。GCRV是双链RNA病毒,属呼肠孤病毒科(... 详细信息

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水经济鱼类,病毒和细菌性疾病对其造成了重大损失[1]。草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病,是对草鱼危害最大的传染性疾病之一。GCRV是双链RNA病毒,属呼肠孤病毒科(Reoviridae),水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus),G亚型[2]。高密度集约化养殖更增长了疾病暴发的频率,严重地影响了草鱼养殖的经济效益。

关键词：草鱼髓样分化因子88 5′侧翼序列内含子启动子活性

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中华鳖源嗜水气单胞菌的研究进展

水产科学 2016年第2期35卷 191-198页

作者：郑杰夫张一柳钟蕾湖南农业大学动物科学技术学院湖南长沙410128

中华鳖（Trionyx sinensis）肉质鲜美,营养丰富,是我国珍贵的淡水名特优水产动物之一。我国中华鳖产量一直居世界产量之首。但近几年中华鳖病原性疾病大量爆发,给我国龟鳖养殖业造成了重大损失。在已经报道的25种中华鳌疾病中,由嗜水气... 详细信息

中华鳖（Trionyx sinensis）肉质鲜美,营养丰富,是我国珍贵的淡水名特优水产动物之一。我国中华鳖产量一直居世界产量之首。但近几年中华鳖病原性疾病大量爆发,给我国龟鳖养殖业造成了重大损失。在已经报道的25种中华鳌疾病中,由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引起的有15种,如红脖子病、腮腺炎病、红底板病、白底板病、腐皮病、疖疮病、穿孔病、烂甲病等[1]。

关键词：中华鳖嗜水气单胞菌生物学特性疾病防治

山姜素对鱼源耐药性嗜水气单胞菌体外抗菌作用的研究

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生物技术通报 2021年第2期37卷 103-110页

作者：陈杰豪缪玉佳梁超陶雨欧阳萍汪开毓耿毅石存斌李宁求农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所广州510380 四川农业大学动物医学院成都611130

旨为探究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的体外抑菌效果及其作用机制。通过测定山姜素对嗜水气单胞菌生长、细菌形态、电导率、乳酸脱氢酶(LDH)、蛋白质代谢和DNA的影响,研究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的抑菌机制。山姜素对5株鱼源耐药性... 详细信息

旨为探究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的体外抑菌效果及其作用机制。通过测定山姜素对嗜水气单胞菌生长、细菌形态、电导率、乳酸脱氢酶(LDH)、蛋白质代谢和DNA的影响,研究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的抑菌机制。山姜素对5株鱼源耐药性嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为128-256μg/mL和512-1024μg/mL。与对照组相比,2MIC山姜素作用于嗜水气单胞菌CW株8 h、16 h后,菌体皱缩,细胞壁和细胞膜破损,细胞质丢失,内部空化;作用2 h后,菌悬液电导率、乳酸脱氢酶含量、DNA外渗量分别增长了3.97%、26.09%和10.50μg/mL;作用2、4和8 h后,菌悬液核酸荧光强度和密度呈现随时间降低的趋势。山姜素对嗜水气单胞菌的体外抑菌机制为损伤菌体的细胞壁、增加细胞膜的通透性来抑制其生长繁殖。

关键词：山姜素嗜水气单胞菌抑菌机制菌体形态

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型结构蛋白的鉴定及部分结构蛋白的免疫原性分析

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草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型结构蛋白的鉴定及部分结构蛋白的免疫原性分析

作者：汤亚方西北农林科技大学

学位级别：硕士

草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病(grass carp hemorrhage disease,GCHD)是严重危害我国草鱼养殖业健康发展的一种烈性传染病,每年可引起大量草鱼死亡而导致巨大的经济损失,被农业部列为二类动物疫病。GCRV基... 详细信息

草鱼呼肠孤病毒(Grass Crap Reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病(grass carp hemorrhage disease,GCHD)是严重危害我国草鱼养殖业健康发展的一种烈性传染病,每年可引起大量草鱼死亡而导致巨大的经济损失,被农业部列为二类动物疫病。GCRV基因组由11个分节段的dsRNA组成,基于病毒基因组序列差异,GCRV总体上可分为3个基因型,近年流行的基因II型是当前草鱼出血病的主要病原。GCRV 11个基因节段均编码相应的功能蛋白,但GCRV Ⅱ型各节段基因编码蛋白的功能尚缺乏系统研究,前期主要是通过生物信息数据库分析和预测所得,不同研究者的结果出入较大,给GCRV Ⅱ型的病毒学基础研究、基因工程疫苗的研制等均造成了困扰。本论文利用病毒纯化、LC-MS/MS、抗体制备、Western-blot、IFA等技术及鱼体试验对GCRV Ⅱ型11个基因节段编码蛋白进行鉴定及目标蛋白进行免疫原性分析,旨在为GCRV Ⅱ型病毒的病原学基础研究及基因工程疫苗等防控产品的开发提供理论依据。研究内容及结果如下:1.病毒纯化及LC-MS/MS分析:用GSB细胞大量扩增GCRV Ⅱ型病毒,然后采用蔗糖密度梯度离心法进行病毒纯化,LC-MS/MS分析纯化的GCRV Ⅱ型病毒。结果显示,可检测到其中9个基因节段编码蛋白的肽段信号,蛋白丰度由高到低分别为S6、S4、S3、S9、S1、S10、S11、S2、S5基因编码的蛋白,说明这9个基因节段编码蛋白可能为病毒的结构蛋白,且S6、S4基因编码蛋白可能为病毒的主要结构蛋白;而未检测到S7、S8基因编码蛋白的肽段信号,这两个基因节段编码蛋白可能为病毒的非结构蛋白。2.抗体制备及结构蛋白鉴定:实验室前期已制备并保存了抗S14、S68、S10、S11基因编码蛋白的抗体;本研究新构建了S5、S9基因编码蛋白的重组原核表达载体,诱导并纯化重组的S5、S9基因编码蛋白,制备了抗S5、S9基因编码蛋白的多克隆抗体。将11个抗体与纯化的GCRV Ⅱ型病毒粒子进行Western blot检测,结果显示,抗S1、S3、S4、S6、S9、S10、S11编码蛋白的抗体与病毒粒子反应呈阳性,而抗S2、S5、S7、S8基因编码蛋白的抗体与病毒粒子反应呈阴性;将GCRV Ⅱ型病毒感染GSB细胞后分别用11个抗体进行IFA检测,结果与Western blot的结果一致;采用中和试验分析7个呈阳性反应抗体的中和活性,将稀释后的抗体分别与GCRV Ⅱ型病毒液等体积混合孵育后感染GSB细胞,RT-qPCR检测感染后的病毒含量。结果显示,与抗S6、S9、S10、S11基因编码蛋白抗体作用的其病毒含量显著降低,其中病毒含量最低的为抗S9基因编码蛋白抗体。说明这4个抗体均有一定的中和活性,其中中和活性最强的为抗S9基因编码蛋白抗体。3.S4、S9基因编码蛋白免疫原性研究:将纯化的S4、S9基因编码蛋白单独或与Seppic Gel佐剂乳化后腹腔注射免疫草鱼。在一免和二免21 d后分别采集草鱼血清、脾脏和头肾组织,通过间接ELISA方法检测草鱼血清的特异性IgM抗体水平变化,通过相对定量PCR方法检测脾脏和头肾中IFN、TLR-3、TLR-7、Mx、IgM基因mRNA相对表达量的变化。结果显示,S4、S9基因编码蛋白加佐剂免疫组草鱼血清OD值范围为0.6.8,S4、S9基因编码蛋白免疫组草鱼血清OD值范围为0.3.5,佐剂组和空白对照组OD值均小于0.2;S4、S9基因编码蛋白加佐剂免疫组5个免疫因子基因mRNA的表达水平约是对照组的75倍,蛋白加佐剂免疫组血清中特异性抗体水平和组织中免疫因子的mRNA表达水平与对照组相比均显著升高(P0.05);攻击感染试验结果表明,S4基因编码蛋白加佐剂免疫组的相对保护率为37.9%,S9基因编码蛋白加佐剂组的相对保护率为34.9%,均对草鱼具有一定的免疫保护作用。综上所述,GCRV Ⅱ型病毒的S1、S3、S4、S6、S9、S10、S11基因节段编码的蛋白可能为病毒的结构蛋白,S2、S5、S7、S8基因编码的蛋白可能为病毒的非结构蛋白,其中S4和S6编码的可能为病毒主要结构蛋白,S9编码蛋白具有较强的中和活性;S4和S9编码蛋白具有较好的免疫原性,对草鱼感染GCRV Ⅱ型强毒株具有一定的免疫保护作用,为基因工程疫苗开发筛选候选抗原提供了依据。

关键词：草鱼出血病草鱼呼肠孤病毒基因组结构蛋白免疫原性

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黄颡鱼溶血性腹水病初探

浙江农业学报 2019年第8期31卷 1239-1248页

作者：杨移斌艾晓辉宋怿董靖胥宁姜兰中国水产科学研究院珠江水产研究所广东广州510380 中国水产科学研究院长江水产研究所湖北武汉430223 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室北京100141

从濒死黄颡鱼腹水中分离到一株细菌HS01,对分离株理化特性及DNA序列进行检测,根据理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列比对,分离株HS01为嗜水气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼出现与自然发病类似症状,并表现强毒力,对黄颡鱼的半致死剂量为2... 详细信息

从濒死黄颡鱼腹水中分离到一株细菌HS01,对分离株理化特性及DNA序列进行检测,根据理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列比对,分离株HS01为嗜水气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼出现与自然发病类似症状,并表现强毒力,对黄颡鱼的半致死剂量为2.51×10^5 CFU·g^-1,且从病灶中分离到与感染菌一致菌株,因此确定嗜水气单胞菌是此次黄颡鱼溶血性腹水病的病原。分离株对头孢唑肟、头孢噻肟、奈替米星及氟苯尼考等10种抗生素高度敏感;对头孢拉定、链霉素、新霉素及卡那霉素等6种抗生素中度敏感;对阿莫西林、青霉素、妥布霉素及红霉素这4种抗生素耐药。本研究为黄颡鱼溶血性腹水病防控提供了理论依据。

关键词：黄颡鱼嗜水气单胞菌分离鉴定病理高通量测序

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饵料对鳡肠道微生物多样性的影响

水生生物学报 2016年第4期40卷 830-835页

作者：钟蕾向建国曾丹李宁求湖南农业大学动物科学技术学院长沙410128 水产动物免疫重点实验室广州510380

通过PCR-DGGE指纹分析并结合克隆、测序对饲喂人工配合饲料和冰鲜鱼两种不同饵料的鳡肠道微生物群落结构及多样性差异进行了比较研究。摄食配合饲料和冰鲜鱼的鳡肠道样品中分别检测到21条和17条清晰的DGGE指纹条带;进一步的克隆、测序及... 详细信息

通过PCR-DGGE指纹分析并结合克隆、测序对饲喂人工配合饲料和冰鲜鱼两种不同饵料的鳡肠道微生物群落结构及多样性差异进行了比较研究。摄食配合饲料和冰鲜鱼的鳡肠道样品中分别检测到21条和17条清晰的DGGE指纹条带;进一步的克隆、测序及BLAST比对分析表明,21条测序谱带与Gen Bank数据库中已知微生物的同源性为98%—100%。配合饲料饲养鳡肠道微生物特有条带代表种群主要为魏斯氏菌(Weissella koreensis)等,冰鲜鱼饲养鳡特有条带代表种为威斯康星米勒菌(Moellerella wisconsensis)等。从PCR-DGGE指纹相似性来看,不同饵料饲养鳡的肠道细菌组成差异较为明显,相似性仅为11.9%—42.6%。鳡肠道菌群的DGGE指纹图谱中条带的H′指数(Shannon-Weiner指数)最高为配合饲料饲养鳡第Ⅴ组样本,达到2.84,最低的为冰鲜鱼饲喂下的鳡第Ⅵ组样本,为2.46。研究结果表明,投喂人工配合饲料和冰鲜鱼会对鳡肠道菌落产生影响,可为鳡饲料的开发提供一定的基础依据。此外,两类鳡的肠道群落PCR-DGGE指纹图谱有助于这两种鳡产品的跟踪和肠道益生菌研究。

关键词：鳡肠道微生物变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE) 16S rDNA