检索结果-南通市图书馆

利用CRISPR/Cas9系统构建SBNO2基因敲除细胞系及其功能研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

甘肃农业大学学报 2021年第1期56卷 22-28页

作者：王妍鳕任亭亭孙跃峰刘磊甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

【目的】草莓缺口同源物2(Strawberry Notch Homolog 2,SBNO2)是参与炎症反应的重要基因之一,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除BHK-21细胞中SBNO2基因,初步探索SBNO2基因敲除后对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响.【方法】首先应用Wester... 详细信息

【目的】草莓缺口同源物2(Strawberry Notch Homolog 2,SBNO2)是参与炎症反应的重要基因之一,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除BHK-21细胞中SBNO2基因,初步探索SBNO2基因敲除后对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响.【方法】首先应用Western Blot方法检测FMDV感染的BHK-21细胞中SBNO2的表达情况.然后根据SBNO2基因设计三组sgRNA,分别插入pSpCas9-puro-2A载体,构建CRISPR/Cas9-SBNO2-sgRNA重组质粒,将重组质粒转染BHK-21细胞.通过扩增基因组SBNO2序列进行测序和Western Blot验证经嘌呤霉素筛选的细胞系中SBNO2基因的敲除情况.最终利用BHK-21-SBNO2基因敲除细胞系检测其对FMDV复制的影响.【结果】sgRNA成功插入pSpCas9-puro-2A载体,Western Blot验证敲除细胞系中SBNO2的蛋白表达下调;扩增SBNO2基因序列的测序结果表明在该基因编辑位点产生移码突变.敲除细胞系感染FMDV后,qRT-PCR结果显示FMDV结构蛋白VP1表达水平显著上调.【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功获得了BHK-21-SBNO2敲除细胞系,并发现SBNO2基因具有抑制FMDV复制的作用,为后续研究SBNO2基因作用于FMDV复制的分子机制奠定了基础.

关键词： CRISPR/Cas9技术口蹄疫病毒 SBNO2基因

重组猪γ干扰素的制备及其抗塞内卡病毒活性研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

重组猪γ干扰素的制备及其抗塞内卡病毒活性研究

作者：王凌云塔里木大学

学位级别：硕士

干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)是一种在先天性和适应性免疫调节中能够起多种作用的细胞因子,还具有抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫和抗癌等生物学活性,已被开发为用于临床的免疫调节药物。已有研究表明,重组猪γ干扰素(rPoIFN-γ)能够... 详细信息

干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)是一种在先天性和适应性免疫调节中能够起多种作用的细胞因子,还具有抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫和抗癌等生物学活性,已被开发为用于临床的免疫调节药物。已有研究表明,重组猪γ干扰素(rPoIFN-γ)能够显著抑制病毒在动物体内的复制。我国作为养猪大国,A型塞内卡病毒(Senecavirua A,SVA)能引起母猪水疱性疾病和新生仔猪急性死亡综合征,感染新生仔猪后死亡率高达70%～80%,已经严重威胁到养猪业的发展。因此,利用基因工程开发具有低成本高活性的抗病毒药物和免疫增强药物尤为重要。本研究采用CHO细胞表达系统生产具有高生物活性的rPoIFN-γ,以SVA为模型病毒分析其体外抗病毒活性,为rPoIFN-γ的功能研究和猪病毒性疾病控制剂的开发提供材料和奠定基础。本研究根据Gen Bank中的猪IFN-γ基因序列合成目的基因片段;合成的目的片段和pc DNA3.1载体质粒分别双酶切后连接,重组质粒经双酶切和测序鉴定;重组质粒pc DNA3.1-Po IFN-γ转染至悬浮培养的CHO细胞中,收集后的上清经镍离子亲和层析柱纯化后,利用SDS-PAGE和Western blot检测技术确定蛋白表达情况。结果显示:酶切和测序结果显示重组质粒pc DNA3.1-Po IFN-γ构建成功;蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测分析,27 k Da左右出现特异性蛋白条带且重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。为检测纯化的rPoIFN-γ的抗病毒活性,通过CCK-8法检测rPoIFN-γ对IBRS-2细胞的毒性作用;通过VSV/PK-15系统,采用细胞病变抑制法(CPEI)测定rPoIFN-γ对水疱性口炎病毒(VSV)的抗病毒效价,探讨rPoIFN-γ对SVA的抗病毒效果;通过病毒滴度测定、q PCR和Western-blot检测rPoIFN-γ在IBRS-2细胞上对SVA的复制作用;通过q PCR检测rPoIFN-γ诱导IBRS-2细胞ISGs和细胞因子表达情况。结果显示:rPoIFN-γ对IBRS-2细胞无毒性作用;rPoIFN-γ在PK-15细胞上对VSV的抗病毒效价为5.59×10U/mg,rPoIFN-γ抗SVA活性效价为6.87×10U/mg。rPoIFN-γ能够显著抑制SVA在IBRS-2细胞的复制(P研究成功制备rPoIFN-γ,并证明其具有较低的细胞毒性和较高的抗病毒活性效价,为rPoIFN-γ的功能分析及抗病毒制剂的研究提供了实验材料和研究基础。

关键词：重组猪IFN-γ A型塞内卡病毒 CHO细胞蛋白表达与纯化抗病毒活性

绵羊痘病毒甘肃流行株ORF121基因的克隆及序列分析

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

畜牧与兽医 2009年第4期41卷 61-63页

作者：陈轶霞才学鹏郑亚东张冬峰骆学农乔自林西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院人兽共患病重点实验室甘肃兰州730046

从甘肃景泰疑似羊痘绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增糖蛋白ORF121基因。序列分析表明,该基因由519个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为19.9 kua,序列中A+T含量占74.95%,G+C含量仅占25.05%。甘肃景泰株ORF121基因同绵羊痘病毒... 详细信息

从甘肃景泰疑似羊痘绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增糖蛋白ORF121基因。序列分析表明,该基因由519个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为19.9 kua,序列中A+T含量占74.95%,G+C含量仅占25.05%。甘肃景泰株ORF121基因同绵羊痘病毒参考株之间的核苷酸同源性高达99%;与疙瘩皮肤病病毒和山羊痘病毒参考株之间的同源性分别为97%和95.6%。结构预测结果显示,ORF121蛋白具有两个N-糖基化位点和一个跨膜区,且具有极强的亲水性。以上结果表明,ORF121蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗或/和诊断价值。

关键词：绵羊痘病毒 ORF121 糖蛋白序列分析

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)蛋白的中华仓鼠卵巢细胞表达及免疫原性分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

生物工程学报 2023年第12期39卷 4861-4873页

作者：李亚军茹毅郝荣增秦晓东卢炳州杨洋刘华南张越龚真莉刘艳红余四九郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

本研究利用中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E^(rns)蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL标准毒株基因序列为基础,构建BVDV E^(rns)蛋白重组真核表达质粒... 详细信息

本研究利用中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E^(rns)蛋白,并分析其免疫原性。以BVDV-1 NADL标准毒株基因序列为基础,构建BVDV E^(rns)蛋白重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E^(rns),转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达。SDS-PAGE分析E^(rns)蛋白的表达和纯化,并用抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清进行Western blotting鉴定纯化蛋白;进一步使用纯化的E^(rns)蛋白免疫新西兰大白兔,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)实验检测血清抗体水平及其免疫反应活性,用病毒中和实验测定免疫兔血清的中和抗体滴度。BCA蛋白定量试剂盒检测纯化的E^(rns)蛋白浓度为0.886 mg/m L,Western blotting结果显示,抗His单克隆抗体和BVDV阳性血清均能够与纯化的E^(rns)蛋白发生特异性免疫反应。间接ELISA和IFA实验结果显示,一免后第7天血清抗体呈阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平可达1:128000,且该血清抗体可以与MDBK细胞中感染的BVDV病毒发生特异性免疫反应。重组E^(rns)蛋白免疫兔可诱导动物机体产生病毒中和抗体,中和效价为log10=2.71。本研究利用CHO细胞表达系统成功制备了纯化的BVDV E^(rns)蛋白,并通过体内和体外实验证明,该重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)诊断方法及新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E^(rns)蛋白真核表达中华仓鼠卵巢(CHO)细胞悬浮培养免疫原性

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

伯氏疏螺旋体的致病性及免疫防治研究进展

中国人兽共患病学报 2016年第1期32卷 83-88页

作者：吴琼周祖平广西师范大学生命科学学院干细胞与医药生物技术实验室桂林541004

伯氏疏螺旋体是莱姆病的病原体,它是由蜱叮咬传播引起的一种自然疫源性疾病。目前莱姆病在很多方面的研究已经取得显著进展,但由于不同基因型甚至是同一基因型不同分离株引起的主要临床症状及致病性都有所不同,而其致病机理尚不完全清楚... 详细信息

伯氏疏螺旋体是莱姆病的病原体,它是由蜱叮咬传播引起的一种自然疫源性疾病。目前莱姆病在很多方面的研究已经取得显著进展,但由于不同基因型甚至是同一基因型不同分离株引起的主要临床症状及致病性都有所不同,而其致病机理尚不完全清楚,主要原因可能是不同基因型伯氏疏螺旋体之间存在传播媒介、致病性、组织嗜性、免疫反应等方面的差异。本文主要就伯氏疏螺旋体从蜱到宿主动物的感染致病以及免疫防御的机制进行了阐述,包括伯氏疏螺旋体的整体分类情况、感染循环、致病机制及疫苗和展望等方面来论述伯氏疏螺旋体的研究进展。这些研究均可为莱姆病的发病机理,临床症状,预防及治疗提供很好的借鉴。

关键词：伯氏疏螺旋体致病性组织嗜性免疫反应

山羊支原体山羊肺炎亚种可视化实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医科学 2022年第6期52卷 671-678页

作者：宋相阳颜新敏付磊陈胜利郝华芳高鹏程刘永生储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为建立快速简便、灵敏度高、特异性强的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)核酸快速检测方法,选择Mccp的92.1基因序列为靶序列,设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,并向反应体系中添加可视化染料羟基溴酚蓝(HNB)或荧光染料(Eva green),分... 详细信息

为建立快速简便、灵敏度高、特异性强的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)核酸快速检测方法,选择Mccp的92.1基因序列为靶序列,设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,并向反应体系中添加可视化染料羟基溴酚蓝(HNB)或荧光染料(Eva green),分别建立Mccp可视化环介导恒温扩增(V-LAMP)和实时荧光环介导恒温扩增(RF-LAMP)检测方法,并对比两种方法的敏感性、特异性、重复性以及两种方法在山羊组织样品中的检测效果。结果显示,两种方法均可检出1.0×10 copies/μL的核酸标准品,灵敏度高;与其他支原体及细菌,如丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌等类症病原体,均无交叉反应;V-LAMP、RF-LAMP的变异系数均小于1%;对人工感染的试验样品和临床样品进行检测,两种检测方法结果一致,阳性率为9.09%,并且与实时定量PCR检测结果一致。本试验建立的V-LAMP和RF-LAMP为Mccp流行病学调查和疾病诊断提供了新的临床快速检测方法。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种可视化环介导恒温扩增实时荧光环介导恒温扩增核酸检测

商品植酸酶及饲粮中植酸酶活性测定的影响因素及变异度

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

动物营养学报 2020年第11期32卷 5397-5405页

作者：吴宇轩苏艳芳赵峰张虎徐二华赵威李浙烽贺喜湖南农业大学动物科技学院长沙410128 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室北京100193 杭州康德权饲料有限公司包膜饲料添加剂省级重点农业企业研究院杭州311107

本试验旨在探讨商品植酸酶及饲粮中植酸酶活性测定的影响因素及变异度。试验分为4个部分。第1部分:考察国标方法中稀释缓冲液类型及溶液显色后离心速度对植酸酶活性测定值的影响。采用2×3两因素完全随机设计,稀释液分别为缓冲液1(乙酸... 详细信息

本试验旨在探讨商品植酸酶及饲粮中植酸酶活性测定的影响因素及变异度。试验分为4个部分。第1部分:考察国标方法中稀释缓冲液类型及溶液显色后离心速度对植酸酶活性测定值的影响。采用2×3两因素完全随机设计,稀释液分别为缓冲液1(乙酸/乙酸钠缓冲液)和缓冲液2(乙酸/乙酸钠+曲拉通X-100+牛血清白蛋白),显色静置10 min后离心速度分别设为3 000、5 000和8 000 r/min。第2部分:考察植酸酶的稀释倍数对植酸酶活性测定值的影响。商品植酸酶的稀释倍数分别设为150、200、250和300倍;饲粮中植酸酶的稀释倍数分别设为5、10和15倍。第3部分:考察饲料原料对植酸酶活性测定的干扰。采用单样本比较设计,在每千克玉米、豆粕、小麦麸、菜籽粕、棉籽粕中添加4 g植酸酶。第4部分:采用单因素完全随机设计,测定14 d内商品植酸酶及饲粮中植酸酶活性的变异。结果表明:1)使用缓冲液1时,饲粮中植酸酶活性的测定值在3 000、5 000和8 000 r/min间无显著差异(P>0.05);而使用缓冲液2时,饲粮中植酸酶活性的测定值随离心速度的增加而显著升高(P<0.05)。2)随着稀释倍数的增加,商品植酸酶活性的测定值先升高后下降(P<0.05),而饲粮中植酸酶活性测定值呈线性下降(P<0.05)。3)在饲料原料中添加植酸酶后,玉米中植酸酶总活性的实测值显著低于计算值(P<0.05),豆粕、小麦麸、菜籽粕和棉籽粕中植酸酶总活性的实测值显著高于计算值(P<0.05)。4)商品植酸酶活性测定值日内变异系数为3.13%,日间变异系数为6.11%,总变异系数为6.68%。饲粮中植酸酶活性测定值的日内变异系数为1.56%,日间变异系数为3.96%,总变异系数为4.19%。由此可见,乙酸/乙酸钠更适合作为植酸酶活性测定中的稀释液,饲粮中植酸酶活性的测定值受离心速度及稀释倍数的影响,而商品植酸酶的活性测定值仅受稀释倍数的影响。饲料原料明显地干扰了植酸酶活性的测定。饲粮中植酸酶活性测定值的变异程度低于商品植酸酶。

关键词：植酸酶影响因素变异

Clade7．2H5N1亚型禽流感重组病毒疫苗株的构建及免疫效力评价

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国预防兽医学报 2016年第7期38卷 580-584页

作者：宋洋铭谷春阳曾显营邓国华杨孝朴陈化兰甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8... 详细信息

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5亚型A/chicken/He Bei BD/SC007/2012(CK/BD/2012)的c DNA为模板经SOE-PCR扩增,将高致病性AIV的HA基因编码裂解位点序列336PQIEGRRRKR348突变为低致病性特征的336PQRETR343序列,以A/chicken/Shanxi/2/2006(CK/SX/2/2006)作为NA基因的供体,构建clade7.2 AIV疫苗候选株r PR8-BD/2012,并对其进行生物学特性和免疫原性评估。结果显示,该疫苗候选株对鸡胚无致病性,能够在鸡胚中高滴度生长(9 log2),静脉内接种致病指数(IVPI)为0,对雏鸡无致病性。将r PR8-CK/BD/2012作为种毒,按照常规方法制备灭活疫苗,免疫4周龄SPF雏鸡,免疫3周后对亲本强毒株的HI平均抗体效价达7.2 log2;采用亲本强毒A/chicken/He Bei BD/SC007/2012和同分支异源强毒株A/chicken/He Bei/SD001/2013以105 EID50剂量攻击,免疫组均能够得到完全保护。以上结果表明r PR8-CK/BD/2012疫苗候选株具有鸡胚适应性、生物安全性和良好的免疫原性,可以作为有效防控clade7.2 H5N1 AIV的疫苗株。

关键词： H5N1 禽流感病毒反向遗传操作系统疫苗株免疫效力评价

链球菌神经氨酸酶的作用机制及酶活性的测定技术

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学报 2019年第3期59卷 433-441页

作者：范玉凤刘广锦南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

神经氨酸酶不仅存在于流感病毒,在细菌中也有分布。细菌的神经氨酸酶可裂解宿主体内糖结合物末端的神经氨酸残基,有助于细菌实现在宿主体内的定殖、穿透和扩散,是细菌重要的毒力因子之一。链球菌是自然界广泛存在的人畜共患的病原菌,在... 详细信息

神经氨酸酶不仅存在于流感病毒,在细菌中也有分布。细菌的神经氨酸酶可裂解宿主体内糖结合物末端的神经氨酸残基,有助于细菌实现在宿主体内的定殖、穿透和扩散,是细菌重要的毒力因子之一。链球菌是自然界广泛存在的人畜共患的病原菌,在多种链球菌中均可检测出神经氨酸酶。肺炎链球菌的神经氨酸酶研究最为透彻,该菌可产生3种神经氨酸酶(NanA,NanB,NanC),NanA不但可以发挥酶的催化作用,分解唾液酸残基,暴露细菌的黏附受体,还能不依赖酶活基团,辅助细菌感染宿主细胞;NanB催化后产物可作为细菌的碳源;NanC可辅助细菌入侵脑部。在无乳链球菌和猪链球菌中,神经氨酸酶的活性一直未得到确切的验证,可能是由于它们的荚膜均含有神经氨酸,所以其神经氨酸酶的活性逐渐在进化中丧失。另外一些链球菌,例如化脓链球菌和C、G、L群链球菌,其神经氨酸酶的底物偏好相近,均对唾液类黏蛋白的催化活性较强,利于链球菌在含唾液类黏蛋白的组织中扩散。在口腔链球菌和血链球菌中,神经氨酸酶破坏血液成分中的神经氨酸链。由此可见,神经氨酸酶的特异性催化作用与链球菌在宿主体内的定植部位密切相关。此外,随着科技的发展,对神经氨酸酶的活性检测,也由早期的硫代巴比妥法,转为现在的荧光值和吸光度的测定,更为便捷和敏感。本文旨在对链球菌的神经氨酸酶的作用机制、与毒力关系及酶活测定方法等研究进展作一综述,为从事相关研究的科学工作者提供参考。

关键词：链球菌神经氨酸酶致病性酶活性