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单链DNA退火蛋白介导细菌基因组同源重组的机制及应用研究进展

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生物技术通报 2024年

作者：尹号尤留超韩瑞高鹏程付磊储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具，而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一，传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题，而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白（SSAP）表现出了... 详细信息

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具，而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一，传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题，而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白（SSAP）表现出了远超内源性重组途径的基因组编辑效率，该蛋白具有单链DNA结合活性、介导基因组定向重组的特点，使其成为目前极具潜力的基因组编辑工具。本文主要对同源重组基本原理、噬菌体源SSAP介导的同源重组途径的基本元件、重组机制模型以及应用策略展开概述，旨在为进一步解析单链DNA退火蛋白介导的同源重组过程提供帮助，为研究更多细菌基因功能、致病机制以及开发工程菌株提供技术支撑，也为缺乏基因编辑方法的细菌提供技术参考。

关键词：细菌单链DNA退火蛋白同源重组机制应用

黄羽肉鸡的品种和生长期对5种饲料原料代谢能的影响

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动物营养学报 2024年第8期36卷 5013-5025页

作者：杜润秀朱沛霁王钰明解竞静叶晓梦尹玉港葛凯靖赵峰刘华伟青岛农业大学动物科技学院青岛266109 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所畜禽营养与饲养全国重点实验室北京100193 江苏立华牧业股份有限公司常州213000

本试验旨在研究黄羽肉鸡的品种和生长期对5种饲料原料代谢能(ME)的影响。采用单因素完全随机试验设计,设4个处理水平,分别为T1:快速型黄羽肉鸡(黄脚麻鸡)-生长前期;T2:快速型黄羽肉鸡-生长中后期;T3:慢速型黄羽肉鸡(雪山草鸡)-生长前期;... 详细信息

本试验旨在研究黄羽肉鸡的品种和生长期对5种饲料原料代谢能(ME)的影响。采用单因素完全随机试验设计,设4个处理水平,分别为T1:快速型黄羽肉鸡(黄脚麻鸡)-生长前期;T2:快速型黄羽肉鸡-生长中后期;T3:慢速型黄羽肉鸡(雪山草鸡)-生长前期;T4:慢速型黄羽肉鸡-生长中后期,每个处理6个重复,每个重复4只鸡。选择26和47日龄的黄脚麻鸡以及33和61日龄的雪山草鸡各144只,通过全收集排泄物法测定玉米-大豆粕基础饲粮及5种试验饲粮(玉米饲粮、小麦饲粮、大豆粕饲粮、花生粕饲粮、玉米蛋白粉饲粮)的表观代谢能(AME)、氮校正表观代谢能(AMEn)及粗蛋白质(CP)代谢率,并计算5种饲料原料(玉米、小麦、大豆粕、花生粕、玉米蛋白粉)的ME(包括AME和AMEn)以及能量代谢率(ME/GE,包括AME/GE和AMEn/GE)。结果显示:快速型黄羽肉鸡对基础饲粮和5种试验饲粮的AME和AMEn均显著低于慢速型黄羽肉鸡(P0.05);慢速型黄羽肉鸡生长中后期对玉米饲粮的AME和AMEn显著高于生长前期(P0.05)。快速型黄羽肉鸡生长中后期对大豆粕的ME/GE和ME显著高于生长前期(P0.05)。慢速型黄羽肉鸡的生长期对5种饲料原料的ME/GE和ME均无显著性影响(P>0.05)。上述结果表明,快速型黄羽肉鸡对5种试验饲粮和4种饲料原料的ME显著低于慢速型黄羽肉鸡,但2个品种肉鸡的生长期对大部分试验饲粮和饲料原料的ME无显著性影响。

关键词：黄羽肉鸡代谢能生长期饲料原料

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牛支原体黏附相关因子的研究进展

畜牧与兽医 2024年第1期56卷 140-144页

作者：杨舒婷李媛王茗雨檀雅洁梁家豪荆婷婷付磊储岳峰兰州大学甘肃兰州730000 中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

牛支原体是严重危害世界养牛业的重要病原之一,可导致牛患肺炎、乳腺炎、关节炎等疾病,在全球范围内流行,给全球养牛业造成了较大经济损失。牛支原体的致病机理尚不清楚,黏附是牛支原体感染宿主并影响宿主细胞膜功能的关键步骤,而黏附... 详细信息

牛支原体是严重危害世界养牛业的重要病原之一,可导致牛患肺炎、乳腺炎、关节炎等疾病,在全球范围内流行,给全球养牛业造成了较大经济损失。牛支原体的致病机理尚不清楚,黏附是牛支原体感染宿主并影响宿主细胞膜功能的关键步骤,而黏附相关因子是牛支原体黏附不同宿主细胞的主要参与者,与牛支原体的致病性相关。本文主要论述了牛支原体黏附相关因子及其作用研究进展,以期为牛支原体致病机制的阐释提供参考。

关键词：牛支原体黏附相关因子致病机制

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绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

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生物技术通报 2024年第7期40卷 323-334页

作者：田彤彤葛家振高鹏程李学瑞宋国栋郑福英储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵... 详细信息

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1060772 bp,GC含量为29.66%,基因组组分分析后发现,GH3-3株的基因组含有730个编码基因,总长度为914379 bp,平均长度为1252.57 bp,占基因组全长的86.2%。串联重复序列共149个,总长为20926 bp,占基因组全长的1.97%。微卫星DNA序列102个,tRNA 30个,rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中,分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释;在VFDB数据库中,共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站,获得登录号为:PRJNA1051969。【结论】获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息,预测和注释了其基因的功能,明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

关键词：绵羊肺炎支原体 GH3-3株全基因组测序毒力因子耐药基因

猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白抗原表位研究进展

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中国兽医科学 2024年

作者：李云涛董雅琴刘晓君曲倩亿盖文燕张慧肖啸魏荣云南农业大学动物医学院中国动物卫生与流行病学中心青岛农业大学山东畜牧兽医职业学院甘肃农业大学动物医学院

猪流行性腹泻（PED）是影响养猪业发展的重要疫病之一，其病原为猪流行性腹泻病毒（PEDV）。该病毒基因型众多，毒株变异较快，不同基因型毒株交叉保护效果差，增加了疫病的防控难度。对病毒抗原表位的深入研究有助于治疗性抗体、疫苗... 详细信息

猪流行性腹泻（PED）是影响养猪业发展的重要疫病之一，其病原为猪流行性腹泻病毒（PEDV）。该病毒基因型众多，毒株变异较快，不同基因型毒株交叉保护效果差，增加了疫病的防控难度。对病毒抗原表位的深入研究有助于治疗性抗体、疫苗或诊断试剂的研发。笔者对PEDV主要结构蛋白抗原表位研究现状进行综述，以期为PED药物、疫苗及诊断试剂的研发提供参考。

关键词： PEDV 结构蛋白抗原表位

腐败梭菌α毒素蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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中国兽医科学 2024年第10期54卷 1309-1317页

作者：马清龙赵佳慧王武斌李学瑞孙雨李斌储岳峰新疆农业大学动物医学学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室青海省动物疫病预防控制中心

为建立绵羊腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法，将腐败梭菌α毒素基因进行密码子优化后，通过基因合成连接到pGEX-4T-1载体，构建重组质粒pGEX-4T-1-α。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)p LysS感受态细菌，用IPTG诱导重组α毒素... 详细信息

为建立绵羊腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法，将腐败梭菌α毒素基因进行密码子优化后，通过基因合成连接到pGEX-4T-1载体，构建重组质粒pGEX-4T-1-α。将重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)p LysS感受态细菌，用IPTG诱导重组α毒素蛋白表达并纯化表达蛋白，切除表达蛋白携带的GST标签后，得到重组腐败梭菌α毒素蛋白。以腐败梭菌α毒素蛋白为包被抗原，建立腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法。结果表明，腐败梭菌α毒素蛋白以200 ng/孔，绵羊血清稀释度为1∶200，封闭液为10 g/L BSA，家兔抗山羊HRP酶标二抗稀释度为1︰8 000，避光显色20 min为最佳的ELISA条件。检测50份阴性血清，计算平均值（x）、标准差（s），依据（x+2s）确定建立的腐败梭菌α毒素抗体间接ELISA检测方法的阴阳性临界值为0.244。检测血清敏感度为1︰6 400；批内、批间重复性试验结果显示，该方法的变异系数均小于10%；特异性试验结果显示，该方法与绵羊B型产气荚膜梭菌、C型产气荚膜梭菌、绵羊布鲁菌、鼠伤寒沙门菌及羊痘病毒阳性血清均无交叉反应。用建立的间接ELISA和商品化腐败梭菌α试剂盒分别检测100份临床血清样本，结果表明这2种方法的阳性符合率为94.87%，阴性符合率为81.97%，总符合率为87.00%。对三联四防疫苗免疫绵羊血清的检测结果表明，本方法的检测结果能够更好地反映出接种疫苗后免疫绵羊血清中抗α毒素抗体的消长情况。该检测方法具有很好的敏感性、重复性和特异性，适用于腐败梭菌感染临床血清样品的检测和腐败梭菌疫苗免疫效果的评价。

关键词：腐败梭菌 α毒素原核表达间接ELISA

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GP35蛋白在牛支原体中互作分子的挖掘

中国兽医科学 2024年

作者：尹号尤留超黄蓉韩瑞高鹏程支飞杰马轲付磊储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

通过在牛支原体中表达GP35蛋白，利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子，将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明，牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白，前者为参与DNA复制过程的重要蛋白，而后者与DNA... 详细信息

通过在牛支原体中表达GP35蛋白，利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子，将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明，牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白，前者为参与DNA复制过程的重要蛋白，而后者与DNA重组过程相关。完成对GP35、SSB和RmuC蛋白的原核表达后，通过pull-down确定了GP35蛋白与SSB蛋白和RmuC蛋白存在互作关系，结果将有助于解析GP35蛋白在牛支原体中介导重组的机制。

关键词：牛支原体 GP35重组酶互作分子同源重组

L929细胞无血清悬浮驯化及其在流产衣原体灭活疫苗中的应用研究

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中国兽药杂志 2024年第4期58卷 1-13页

作者：刘东慧李兆才梁林谭书敏闫海全白天俊王淑芳闫文军周继章中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础科学研究中心兰州730046 天祝县动物疫病预防控制中心甘肃武威733000

为通过悬浮细胞培养方法规模化生产流产衣原体抗原,采用逐步降血清悬浮驯化法使贴壁L929细胞逐步适应悬浮培养环境,最终获得了一株可无血清悬浮培养的L929细胞株。将流产衣原体接种于L929悬浮细胞上,研究不同的促感染试剂以提高收菌量,... 详细信息

为通过悬浮细胞培养方法规模化生产流产衣原体抗原,采用逐步降血清悬浮驯化法使贴壁L929细胞逐步适应悬浮培养环境,最终获得了一株可无血清悬浮培养的L929细胞株。将流产衣原体接种于L929悬浮细胞上,研究不同的促感染试剂以提高收菌量,并选择出最佳的培养方法制备流产衣原体灭活疫苗。以25μL、50μL、100μL的剂量免疫Balb/c小鼠,攻毒后检测其免疫保护效果。结果显示,当该L929悬浮细胞初始接种密度为5×10^(5)/mL时,培养72 h后细胞浓度可达到约7×10^(6)/mL,细胞活力在95%以上;在细胞密度为6×10^(6)/mL,接菌量为5.5×10^(4) IFU/mL,加入脂质体2000的量为1.7μL/mL、放线菌酮浓度为0.4μg/mL时,菌量增殖倍数最大,48 h内约扩增了52倍。经流产衣原体悬浮培养细胞灭活疫苗免疫后,小鼠产生的抗体水平随免疫剂量的增加而提升;接种50μL、100μL疫苗组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、IFN-γ、IL-2的含量远高于接种25μL疫苗和注射PBS组的小鼠;对免疫后的小鼠进行攻毒,接种疫苗组小鼠的脾脏、十二指肠、子宫中的流产衣原体基因组含量远低于未接种疫苗组小鼠。注射PBS组及接种25μL疫苗组的小鼠子宫出现了不同程度的坏死及炎症,而其余两组小鼠的子宫无异常变化。结果表明,本试验成功驯化出1株L929悬浮培养细胞株,并且通过悬浮培养工艺制备的流产衣原体灭活疫苗免疫效果良好,接种50μL、100μL该灭活疫苗可以有效抑制流产衣原体的感染,该L929细胞全悬浮培养株的成功驯化为疫苗规模化生产提供了技术支持。

关键词： L929贴壁细胞悬浮培养驯化流产衣原体灭活疫苗免疫评价

牛支原体LRR5蛋白原核表达及其在牛支原体入侵宿主细胞过程中的作用分析

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微生物学报 2024年第5期64卷 1469-1482页

作者：冯雅茹周梦婷张瑜瑜张格高鹏程冉多良许健储岳峰李斌新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 新疆草食动物新药研究与创制重点实验室新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasma bovis)MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并... 详细信息

致病性支原体具有入侵宿主细胞的能力,这是其发挥致病作用的关键。介导支原体入侵宿主细胞的自身功能蛋白可能是一种潜在的药物或疫苗靶标。【目的】克隆表达牛支原体(Mycoplasma bovis)MBOVPG45_0564基因编码蛋白(命名为LRR5蛋白),并探究其在***入侵宿主细胞过程中的作用。【方法】利用NCBI数据库对MBOVPG45_0564基因进行同源性分析,用Discovery Studio Client系统对LRR5蛋白进行蛋白结构预测;原核表达LRR5蛋白并制备其小鼠多克隆抗体,利用免疫电镜对LRR5蛋白进行亚细胞定位;通过平板计数、激光共聚焦显微镜观察LRR5抗体封闭后***对胎牛肺(embryonic bovine lung,EBL)细胞入侵率的变化;将LRR5蛋白偶联至荧光微球表面后,以激光共聚焦显微镜及高内涵活细胞成像系统观察微球进入EBL细胞情况。【结果】MBOVPG45_0564基因在牛支原体属中为保守基因,其编码蛋白LRR5为膜相关蛋白,空间构象呈典型的月牙状,多个重复的亮氨酸基序以超螺旋方式组装并形成螺线管蛋白质结构单元。LRR5抗体封闭后,***对EBL细胞的入侵率显著降低(P<0.05),荧光微球偶联LRR5蛋白后,荧光微球可成功进入EBL细胞。【结论】MBOVPG45_0564基因编码的LRR5蛋白定位在***膜上,在***入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。

关键词：牛支原体 MBOVPG45_0564基因入侵蛋白表达生物学功能