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白介素15蛋白的抗体制备及其在猪繁殖与呼吸综合征病毒活载体中的表达

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中国动物传染病学报 2024年

作者：郭子强李佳乐罗梦唐银保帅文娜李丽薇周艳君童武姜一峰童光志高飞中国农业科学院上海兽医研究所广西大学动物科学技术学院南京农业大学动物医学院扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心上海市兽医生物技术重点实验室

本研究旨在制备IL15多克隆抗体，并使用质粒pCDNA3.1-IL15和重组病毒rPRRSV-IL15进行验证。首先构建原核表达质粒pET-IL15，经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析，利用纯化后得到的IL15重组蛋白三次免疫兔... 详细信息

本研究旨在制备IL15多克隆抗体，并使用质粒pCDNA3.1-IL15和重组病毒rPRRSV-IL15进行验证。首先构建原核表达质粒pET-IL15，经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析，利用纯化后得到的IL15重组蛋白三次免疫兔后制备多克隆抗体。同时，利用反向遗传操作技术将IL15基因插入高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株vHuN4-F112的感染性克隆中，拯救获得能够稳定表达IL15蛋白的重组病毒rPRRSV-IL15。接着，将表达IL15蛋白的质粒pCDNA3.1-IL15转染HEK 293T细胞，rPRRSV-IL15感染MARC-145细胞和PAMs后，用上述制备的抗体进行验证。结果显示，制备的IL15多克隆抗体具有良好的反应性和特异性，能够识别和结合转染了pCDNA3.1-IL15质粒和感染了rPRRSV-IL15重组病毒的细胞中的IL15蛋白，为进一步研究IL15蛋白的生物学功能以及其在免疫调节中的作用奠定了重要基础，重组病毒rPRRSV-IL15也是新型免疫增强型PRRSV弱毒疫苗研制的一种尝试。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒活载体 IL15蛋白多克隆抗体

猪细小病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年

作者：帅文娜郭子强李佳乐罗梦李丽薇周艳君姜一峰童武童光志李兆龙高飞中国农业科学院上海兽医研究所广西大学动物科学技术学院扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心福建省农业科学院畜牧兽医研究所上海市兽医生物技术重点实验室

本研究通过对猪细小病毒（PPV）1型非结构蛋白NS1基因保守序列进行设计，建立了PPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法，实现了对PPV1的快速检测。结果显示，该检测方法的Ct值与标准品质粒在1.0×1010copies/μL～1.0×104copies/μL具有良好... 详细信息

本研究通过对猪细小病毒（PPV）1型非结构蛋白NS1基因保守序列进行设计，建立了PPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法，实现了对PPV1的快速检测。结果显示，该检测方法的Ct值与标准品质粒在1.0×1010copies/μL～1.0×104copies/μL具有良好的线性关系，曲线回归方程为y=-3.618 6x+42.01，R2=0.99，扩增效率为189%；重复性好，组内与组间变异系数均低于1.089 8%；敏感性好，最低检测限度为1.0×101copies/μL；特异性强，不与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、非洲猪瘟病毒之间发生交叉反应，并用该方法对临床样品与病毒拷贝数进行了检测。表明本研究建立的方法重复性好、敏感性高、特异性强，适用于对PPV进行临床检测与诊断。

关键词：猪细小病毒 NS1蛋白 TaqMan实时荧光定量PCR

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A型塞内卡病毒VP1蛋白的抗体制备及鉴定

中国兽医科学 2024年

作者：李佳乐郭子强罗梦唐银保帅文娜李丽薇周艳君姜一峰童武童光志丛雁方高飞中国农业科学院上海兽医研究所广西大学动物科学技术学院南京农业大学动物医学院扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心青岛动保国家工程技术研究中心有限公司

本研究旨在制备A型塞内卡病毒（SVA）VP1的多克隆抗体，并用重组病毒rPRRSV-SVA-VP1和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc进行验证。首先对VP1序列进行优化分析，合成序列后插入克隆载体中，构建原核表达质粒pET-VP1，并转化至感受态*** BL21（DE... 详细信息

本研究旨在制备A型塞内卡病毒（SVA）VP1的多克隆抗体，并用重组病毒rPRRSV-SVA-VP1和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc进行验证。首先对VP1序列进行优化分析，合成序列后插入克隆载体中，构建原核表达质粒pET-VP1，并转化至感受态*** BL21（DE3）细胞，经IPTG诱导后，获得重组VP1蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备获得重组VP1蛋白的多克隆抗体。此外，利用本团队构建并保存的能够稳定表达SVA VP1蛋白的重组病毒rPRRSV-SVA-VP1感染Marc-145细胞后，用上述制备的VP1多克隆抗体进行验证。结果显示，pET-VP1在大肠杆菌中于37 ℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h，成功表达约37 ku目的蛋白；Western-blot结果显示，制备的多克隆抗体能特异性识别VP1蛋白；间接免疫荧光试验表明，制备的多克隆抗体能够特异性识别rPRRSV-SVA-VP1感染Marc-145细胞后表达的VP1蛋白和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc转染至293T细胞后表达的VP1蛋白。上述结果表明，本研究制备的VP1多克隆抗体具有良好的反应性和特异性，为SVA血清学检测方法的建立以及SVA VP1蛋白的生物学功能的研究奠定了基础。

关键词： A型塞内卡病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒 VP1蛋白多克隆抗体原核表达活病毒载体

非洲猪瘟病毒B602L基因编码蛋白的多克隆抗体的制备及其在PRRSV活载体中的表达

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中国兽医科学 2024年

作者：罗梦郭子强李佳乐帅文娜李丽薇周艳君姜一峰童武童光志丛雁方韦祖樟高飞广西大学动物科学技术学院中国农业科学院上海兽医研究所扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心青岛动保国家工程技术研究中心有限公司上海市兽医生物技术重点实验室

为深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的编码基因B602L，本研究根据ASFV-SY18株的B602L基因序列(MH766894.3)，设计引物合成1 593 bp的B602L基因全长序列，构建pCold-TF-B602L原核重组质粒。将鉴定正确的原核质粒... 详细信息

为深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的编码基因B602L，本研究根据ASFV-SY18株的B602L基因序列(MH766894.3)，设计引物合成1 593 bp的B602L基因全长序列，构建pCold-TF-B602L原核重组质粒。将鉴定正确的原核质粒转化至感受态细胞，用IPTG诱导表达重组蛋白B602L并通过SDS-PAGE进行验证和分析。用纯化后的pB602L蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，测定抗体效价并经Western-blot鉴定其特异性。同时基于本实验室前期研究，构建表达B602L基因编码蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)全长感染性克隆。本研究将ASFV B602L基因全长序列插入PRRSV ORF1b和ORF2a之间，转染全长感染性克隆质粒后拯救获得重组病毒rPRRSV-B602L，并对其进行病毒学特性分析。利用制备的多克隆抗体与重组病毒和真核质粒进行Western-blot和IFA验证。结果显示，成功构建pCold-TF-B602L原核质粒，诱导表达的重组蛋白pB602L可与His标签单抗和制备的抗pB602L抗体产生特异性反应，其效价为1∶16 000；成功构建并拯救出重组病毒rPRRSV-B602L，其与亲本病毒具有相似的病毒学特性。本研究拯救的重组病毒可以稳定表达pB602L蛋白，该抗pB602L多克隆抗体能够特异性识别重组病毒表达的蛋白和真核质粒表达的蛋白，具有良好的特异性和反应原性，为进一步探索pB602L蛋白的功能及研制表达ASFV特异性抗原蛋白的重组PRRSV活载体疫苗提供一定的研究基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 pB602L蛋白多克隆抗体病毒活载体

成人T细胞白血病细胞靶向型水泡性口炎病毒的构建及应用

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生物化学与生物物理进展 2011年第3期38卷 218-226页

作者：方心葵王欣孙涛上海交通大学农业与生物学院上海200240 上海市兽医生物技术重点实验室上海200240

目前肿瘤治疗主要使用放疗、药物化疗,具有很大的毒、副作用,研发肿瘤靶向性药物是未来发展趋势.成人T细胞白血病(adult T cell leukemia,ATL)是一种由HTLV-1病毒引起的人恶性CD4 T淋巴细胞白血病,目前尚无有效治疗方法.溶瘤性水泡性口... 详细信息

目前肿瘤治疗主要使用放疗、药物化疗,具有很大的毒、副作用,研发肿瘤靶向性药物是未来发展趋势.成人T细胞白血病(adult T cell leukemia,ATL)是一种由HTLV-1病毒引起的人恶性CD4 T淋巴细胞白血病,目前尚无有效治疗方法.溶瘤性水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)是一种肿瘤治疗病毒载体,利用HIV-1囊膜蛋白gp160对野生型VSV病毒进行假型化改造,研制了具备人CD4受体靶向性的重组VSV病毒(VSV-△G-gp160G),在对ATL病人肿瘤细胞进行的体外杀伤实验(ex vivo)中,显示出良好的应用前景.

关键词：水泡性口炎病毒成人T细胞白血病病毒治疗

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鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

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中国农业科学 2019年第6期52卷 1102-1109页

作者：栗永华车路平仇旭升谭磊孙英杰刘炜炜宋翠萍廖瑛丁铲王金泉孟春春新疆农业大学动物医学学院中国农业科学院上海兽医研究所

【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】... 详细信息

【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧（Reactive oxygen species,ROS）并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank（登录号:XM;17232.6）中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体（Flag-CMV14）后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase（PARP）裂解情况。此外还将重组质粒（Flag-TIGAR）转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒（Flag-TIGAR）经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒（Flag-TIGAR）的实验组与未转染质粒（MOCK）组或转染空载体（Flag-CMV14）组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著（P实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。

关键词： TIGAR 真核表达质粒新城疫病毒抗凋亡鸡

基于免疫胶体金试纸条检测盐酸克伦特罗的便携式光电型传感器

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分析化学 2012年第6期40卷 852-856页

作者：张洪才刘春燕刘国艳陈小连叶雨丹王艺如柴春彦上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室

利用免疫竞争抗制原理制备检测盐酸克伦特罗的免疫纳米金试纸条,盐酸克伦特罗与CLB-BSA复合物竞争性结合胶体金上抗体的有限位点,从而使试纸条上的检测带显色减弱或消失。将显色后的试纸条插入自行研制的光电型传感器的测试孔内,根据反... 详细信息

利用免疫竞争抗制原理制备检测盐酸克伦特罗的免疫纳米金试纸条,盐酸克伦特罗与CLB-BSA复合物竞争性结合胶体金上抗体的有限位点,从而使试纸条上的检测带显色减弱或消失。将显色后的试纸条插入自行研制的光电型传感器的测试孔内,根据反射光的强弱计算出克伦特罗的浓度。结果表明:用光电传感方法检测盐酸克伦特罗的线性范围为1～10μg/L,检出限为0.05μg/L,回收率为85.5%～96.0%。此光电型传感器检测克伦特罗具有简便、快速、灵敏、特异性强的优点。

关键词：盐酸克伦特罗光电型传感器免疫胶体金试纸条猪尿

来源：博看期刊

稳定表达TIGAR基因的BHK-21细胞系的构建及其对新城疫病毒增殖效果的评价

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畜牧兽医学报 2021年第2期52卷 440-449页

作者：栗永华刘伟徐智凯刘炜玮孙英杰仇旭升谭磊宋翠萍廖瑛丁铲孟春春中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒(NDV)引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平... 详细信息

TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒(NDV)引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平,有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠TIGAR基因和鸡TIGAR基因设计引物,分别扩增仓鼠和鸡的TIGAR基因,并构建各自的慢病毒包装质粒,以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达TIGAR细胞系(BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR)。使用Western blot、DNA测序和qPCR对TIGAR基因表达水平进行鉴定,Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系,测定病毒滴度。结果显示:重组细胞系BHK-21-chTIGAR细胞和BHK-21-hamTIGAR细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功,TIGAR基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示,TIGAR基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示:BHK-21-hamTIGAR细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chTIGAR细胞;病毒生长曲线结果显示:强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(5.67,72 h)高于BHK-21-chTIGAR细胞(5.53,72 h)和野生型BHK-21细胞(5.27,72 h);中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(4.90,96 h)要高于BHK-21-chTIGAR细胞(4.57,96 h)和野生型BHK-21细胞(4.67,96 h);弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(4.07,96 h)要高于BHK-21-chTIGAR细胞(3.90,96 h)和野生型BHK-21细胞(3.77,96 h)。综上所述,所构建的BHK-21-hamTIGAR细胞系具有明显的抗凋亡功能,且有利于新城疫病毒的高水平复制,有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。

关键词： TIGAR 凋亡抗凋亡新城疫病毒病毒滴度

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检测猪肉中地西泮的分子印迹仿生传感器的研制

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分析化学 2010年第5期38卷 683-687页

作者：刘晓芳姚冰刘国艳柴春彦上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室

在一次性丝网印刷电极上原位制备地西泮的分子印迹膜,将丝网印刷电极通过电极插口与便携式电导仪相连接,组装成检测地西泮残留的电导型传感器,建立了检测地西泮的标准曲线并测试了实际肉类样品中的地西泮含量。通过扫描电镜分析了该膜... 详细信息

在一次性丝网印刷电极上原位制备地西泮的分子印迹膜,将丝网印刷电极通过电极插口与便携式电导仪相连接,组装成检测地西泮残留的电导型传感器,建立了检测地西泮的标准曲线并测试了实际肉类样品中的地西泮含量。通过扫描电镜分析了该膜的表征,与非印迹膜相比,印迹膜表面形成了大量印迹微孔。本传感器装置对地西泮具有很高的灵敏度和特异性,检出限为0.008mg/L,线性范围为0.039～1.25mg/L,基于肉品的检测回收率为91.3%～95.0%,可实现现场快速检测。

关键词：地西泮分子印迹膜电导型传感器