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基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定

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中国农业科技导报 2018年第11期20卷 22-28页

作者：杨羊梁成真孟志刚陈全家罗淑萍张锐郭三堆新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringie... 详细信息

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt) Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体(Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS)将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。

关键词： Bt cry1Ac GR79 EPSPS 烟草抗虫抗草甘膦

AtNEK6在棉花旱盐胁迫响应中的功能分析

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中国农业科学 2018年第22期51卷 4230-4240页

作者：范鑫赵雷霖翟红红王远孟志刚梁成真张锐郭三堆孙国清中国农业科学院生物技术研究所

【目的】AtNEK6是在拟南芥中发现的一种NIMA相关激酶,在拟南芥中过表达AtNEK6能够促进植物的生长发育,提高植物的耐盐耐旱性。通过将AtNEK6转化棉花,研究其在抗逆中的分子机理,为培育耐旱耐盐碱棉花新品种提供理论基础和种质资源。【方... 详细信息

【目的】AtNEK6是在拟南芥中发现的一种NIMA相关激酶,在拟南芥中过表达AtNEK6能够促进植物的生长发育,提高植物的耐盐耐旱性。通过将AtNEK6转化棉花,研究其在抗逆中的分子机理,为培育耐旱耐盐碱棉花新品种提供理论基础和种质资源。【方法】采用农杆菌转化法,将来源于拟南芥的AtNEK6导入棉花,通过实时荧光定量PCR分析转基因株系中AtNEK6的表达量;通过观察转基因植株表型和扫描电镜观察细胞表皮细胞,分析转基因棉花的生长发育情况;利用甘露醇和NaCl模拟干旱处理和盐处理分析转基因棉花的耐盐耐旱能力,通过测定相关生理指标,鉴定AtNEK6对转基因棉花耐逆的贡献。【结果】利用卡那霉素筛选获得转基因幼苗,通过PCR鉴定获得10个不同的转基因株系;利用qRT-PCR分析筛选出表达量较高的L7、L17、L25株系。正常条件下,与野生型相比,转基因棉花的株高增高、叶面积增大,生长发育得到了促进,通过扫描电镜观察发现转基因棉花叶片的细胞表面积与野生型并无明显差异,细胞周期相关基因CYCB1;1和CYCA3;1及生长发育相关基因GhGRF5、GhEOD、GhAN3和GhEBP1的表达量均上调。通过耐盐耐旱性分析,正常条件下,与野生型相比,转基因株系的根长、鲜重和干重均无明显差异,仅侧根数增多;在250 mmol·L;甘露醇处理条件下,转基因株系的根长、侧根数、鲜重和干重均显著高于野生型,表现出更好的生长状态;在200 mmol·L;NaCl处理条件下,转基因株系的侧根数、鲜重和干重均显著高于野生型,相比于野生型生长状态更好。温室中正常生长1月龄的转基因棉花,在300 mmol·L;甘露醇处理条件下,转基因植株的SOD活性比野生型提高了0.65倍、0.42倍和1.45倍,CAT活性提高了0.65倍、0.64倍和0.42倍,MDA含量降低了0.51倍、0.41倍和0.22倍;250 mmol·L;NaCl处理结果与甘露醇类似,转基因棉花的耐盐生理指标均优于野生型。另外,相关胁迫响应基因GhAREB、GhDREB、GhNCED和GhLEA5在转基因棉花中的表达量均显著高于野生型棉花。【结论】AtNEK6通过参与细胞周期和生长发育的调控过程促进棉花的生长发育,同时提高棉花在逆境中的耐盐耐旱性。

关键词： AtNEK6 转基因棉花耐盐耐旱性功能分析

耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性分析及性状鉴定

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中国农业科学 2023年第17期56卷 3251-3261页

作者：梁成真臧有义孟志刚王远 MUBASHIR Abbas 何海焱周琪魏云晓张锐郭三堆中国农业科学院生物技术研究所

【目的】明确转基因耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性和营养品质等性状，为其产业化应用提供数据基础和技术支撑。【方法】针对实验室培育的新型耐除草剂棉花GGK2，选取其T3、T4、T5代开展试验研究。利用特异性PCR和Southern blot开展基因... 详细信息

【目的】明确转基因耐除草剂棉花GGK2的遗传稳定性和营养品质等性状，为其产业化应用提供数据基础和技术支撑。【方法】针对实验室培育的新型耐除草剂棉花GGK2，选取其T3、T4、T5代开展试验研究。利用特异性PCR和Southern blot开展基因组整合稳定性分析；利用实时荧光定量PCR、ELISA和胶体金试纸条开展表达稳定性分析；通过田间喷施草甘膦测试其除草剂耐受稳定性，以及依据相关国际或国内行业标准进行棉籽营养成分分析等。【结果】抗除草剂基因GR79 EPSPS和GAT，以及筛选标记基因NPTⅡ以单拷贝形式整合到棉花GGK2基因组D10染色体，且能够在T3、T4、T5代转基因棉花中稳定遗传，同时发现基因组中不含有遗传转化载体的骨架片段。表达分析发现GR79 EPSPS、GAT和NPTⅡ3个基因在棉花GGK2的不同时期、不同组织部位均有表达，其中，叶片中的表达量相对较高。四叶期、盛花期、吐絮期3个蛋白在叶片中表达量分别介于128.7—192.4μg·g-1、24.4—35.0μg·g-1和17.0—23.9μg·g-1鲜重，利用GR79 EPSPS单克隆抗体制备的胶体金试纸条可以对田间棉花GGK2叶片实现快速鉴定。除草剂耐受性分析结果显示，转基因棉花GGK2可耐受4倍生产使用剂量的草甘膦除草剂。T3—T5不同世代棉花喷施除草剂后均未发现受害症状，而且整个生育期的生长发育未受影响。棉籽营养成分分析表明，来源于新疆、河北和河南种植的GGK2棉籽中，水分、灰分、蛋白质、脂肪、粗纤维、维生素及脂肪酸含量与非转基因对照之间无显著差异，各指标的含量水平均位于ILSI数据库报道的范围内。【结论】转基因棉花新种质GGK2的耐除草剂性状遗传稳定性好、除草剂耐受能力强、籽粒营养成分与非转基因对照之间无显著差异，在耐除草剂棉花生物育种具有重要的应用价值且产业化前景好。

关键词：棉花 GGK2 耐除草剂草甘膦遗传稳定性

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BS2基因在烟草中的功能解析

中国农业科技导报 2019年第11期21卷 43-50页

作者：李霞范鑫梁成真王远张锐孟志刚刘晓东孙国清新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

BS2蛋白来源于枯草芽孢杆菌B111,具有较强的黄萎病抗性,能抑制黄萎病菌孢子萌发并破坏其菌丝生长。BS2基因全长1 566 bp,共522个密码子,由于物种间偏爱密码子的差异,若不对其进行密码子优化而直接导入植物,会造成基因表达量低甚至不表... 详细信息

BS2蛋白来源于枯草芽孢杆菌B111,具有较强的黄萎病抗性,能抑制黄萎病菌孢子萌发并破坏其菌丝生长。BS2基因全长1 566 bp,共522个密码子,由于物种间偏爱密码子的差异,若不对其进行密码子优化而直接导入植物,会造成基因表达量低甚至不表达。按植物密码子对BS2基因进行优化合成,共优化了332个密码子;生物信息学分析得出:1~28位氨基酸为N端信号肽,成熟的BS2蛋白由224~521位氨基酸构成,是一种中性锌金属肽酶;亚细胞定位将BS2蛋白定位于细胞膜;牛津杯法检测得出转基因烟草株系的蛋白粗提液有很强的抑菌活性;未侵染黄萎病菌的对照组,T1代转基因植株与野生型长势基本一致、表型无明显差异;黄萎病菌V991侵染组,转基因烟草的表型性状明显优于野生型,且两组中转基因烟草的SOD、CAT活性和SA、ABA含量均显著高于野生型,说明BS2基因可以显著提高转基因烟草的黄萎病抗性。

关键词： BS2 生物信息学分析转基因烟草黄萎病抗性

优化的反向PCR结合TAIL-PCR法克隆棉花线粒体atpA双拷贝基因及其侧翼序列

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生物工程学报 2012年第1期28卷 104-115页

作者：张晓张锐孙国清史计孟志刚周焘侯思宇梁成真于源华郭三堆中国农业科学院生物技术研究所国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程北京100081 长春理工大学生命科学技术学院吉林长春130022

双拷贝基因及其侧翼序列的克隆是分子生物学中的一个难点。将优化的反向PCR(Inverse PCR,iPCR)与TAIL-PCR相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。先用Southern blotting方法确定一种能获得合适长度片段的限制性内切酶,然后用优化的i... 详细信息

双拷贝基因及其侧翼序列的克隆是分子生物学中的一个难点。将优化的反向PCR(Inverse PCR,iPCR)与TAIL-PCR相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。先用Southern blotting方法确定一种能获得合适长度片段的限制性内切酶,然后用优化的iPCR方法对该酶切产物进行自连和扩增,将2个拷贝的侧翼序列区分开。根据iPCR结果,进一步用TAIL-PCR扩增更远侧翼的序列。利用这套方法,获得了棉花可育胞质和不育胞质线粒体双拷贝atpA基因的所有EcoR I限制片段(2.2～5.1 kb)和HindⅢ限制片段(8.5～11.7 kb),克隆到2个拷贝各自的侧翼序列。研究结果说明,优化的iPCR与TAIL-PCR相结合是克隆双拷贝基因及其侧翼序列的一种高效方法。

关键词：反向PCR TAIL-PCR 细胞质雄性不育棉花 atpA 双拷贝基因侧翼序列

“Slope-adsorption & plateau-pore filling” mechanism unlocking the potential of hard carbon anodes for “fast-charging & large-sized”batteries

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Science China Materials 2025年第1期 309-311页

作者： Tian liang Xiaoming Zhu Hubei Key Laboratory of Radiation Chemistry and Functional Materials School of Nuclear Technology and Chemistry & Biology Hubei University of Science and Technology

To date, there has been no report on fast-charging and Ahlevel sodium-ion batteries (SIBs) by utilizing thick hard carbon anodes that demonstrate prolonged cycling life and high areal capacity at high rates. Further, the relationship among the complex structure of hard carbon, storage mechanism, and fastcharging performance in alkali-metal ion batteries has been a subject of ongoing debate [1,2].

关键词：

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后路寰枢椎椎弓根非融合固定治疗Ⅱ型齿突骨折

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中华骨科杂志 2015年第5期35卷 542-550页

作者：韩斌陈其昕李方财陈刚梁成振李浩陶轶卿王海超浙江大学医学院附属第二医院骨科杭州310009

目的探讨后路寰枢椎椎弓根钉棒内固定非融合治疗不适合前路齿突螺钉固定的Ⅱ型齿突骨折以保留寰枢椎旋转功能的临床疗效.方法 2012至2013年期间,选取13例不适合行前路齿突螺钉固定的Ⅱ型齿突骨折患者,男10例,女3例;年龄18～62岁,平均40... 详细信息

目的探讨后路寰枢椎椎弓根钉棒内固定非融合治疗不适合前路齿突螺钉固定的Ⅱ型齿突骨折以保留寰枢椎旋转功能的临床疗效.方法 2012至2013年期间,选取13例不适合行前路齿突螺钉固定的Ⅱ型齿突骨折患者,男10例,女3例;年龄18～62岁,平均40岁.采用一期寰枢椎后路椎弓根钉棒复位内固定,术中不进行植骨融合,术后复查CT显示骨折骨性愈合后取出内固定,在内固定拆除至少1个月后采用动力位CT评估寰枢椎及颈椎总体旋转活动度的保留情况,采用文献报道的颈椎总体旋转活动度正常值作为历史对照.结果 13例患者成功置入直径3.5 mm的寰枢椎椎弓根螺钉共计52枚,螺钉长度为24～28 mm.术中骨折复位满意,未发生脊髓及椎动脉损伤等严重并发症.所有患者均得到随访,随访时间7～20个月,平均（14.2 ± 4.5）个月.术后骨折骨性愈合时间6～15个月,平均（9.0±2.8）个月.骨折骨性愈合即行二期手术拆除内固定,期间无内固定失败.手术前后患者颈痛症状明显改善,视觉模拟疼痛评分（visual analogue pain score,VAS）自术前平均（7.5±1.0）分（6～9分）下降至内固定拆除术后末次随访的（2.3±0.6）分（1～3分）,差异有统计学意义.动力位CT显示术后寰枢椎旋转活动度平均向左17.0°、向右17.2°,寰枢椎总体旋转活动度平均为34.2°;术后颈椎旋转活动度平均向左59.7°、向右56.8°,颈椎总体旋转活动度平均为116.5°.术后寰枢椎总体旋转活动度下降至颈椎总体旋转活动度的27.3％,颈椎总体旋转活动度下降至同年龄组、同性别正常人群的78.2％.结论后路寰枢椎椎弓根内固定非融合治疗不适合前路齿突螺钉固定的Ⅱ型齿突骨折可以在一定程度上保留寰枢椎的旋转活动度.

关键词：齿突尖骨折骨折固定术,内治疗结果

The dopaminergic system and Alzheimer's disease

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Neural Regeneration Research 2025年第9期20卷 2495-2512页

作者： Yuhan Zhang Yuan liang Yixue Gu International Medical College Chongqing Medical UniversityChongqingChina College of Pharmacy Chongqing Medical UniversityChongqingChina Department of Neurology The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing Key Laboratory of NeurologyChongqingChina

Alzheimer's disease is a common neurodegenerative disorder in older *** its prevalence,its pathogenesis remains unclea *** addition to the most widely accepted causes,which in clude excessive amyloid-beta aggregation,tau hyperphosphorylation,and deficiency of the neurotransmitter acetylcholine,numerous studies have shown that the dopaminergic system is also closely associated with the occurrence and development of this *** is a crucial catecholaminergic neurotransmitter in the human ***-associated treatments,such as drugs that target dopamine receptor D and dopamine analogs,can improve cognitive function and alleviate psychiatric symptoms as well as ameliorate other clinical *** r,therapeutics targeting the dopaminergic system are associated with various adverse reactions,such as addiction and exacerbation of cognitive *** review summarizes the role of the dopaminergic system in the pathology of Alzheimer's disease,focusing on currently available dopamine-based therapies for this disorder and the common side effects associated with dopamine-related *** aim of this review is to provide insights into the potential connections between the dopaminergic system and Alzheimer's disease,thus helping to clarify the mechanisms underlying the condition and exploring more effective therapeutic options.

关键词： adverse drug reaction Alzheimer's disease catecholamine dopamine receptor dopamine receptor heterodimers dopaminergic system neurodegenerative disease neurotransmitter signaling pathways traditional Chinese medicine treatment

退变椎间盘的酸性微环境对髓核间质干细胞和脂肪间质干细胞的影响

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中华骨科杂志 2015年第12期35卷 1243-1252页

作者：韩斌王海超叶陈毅陶轶卿李浩梁成振陈刚李方财陈其昕浙江大学医学院附属第二医院骨科杭州310009

目的体外模拟退变椎间盘的酸性微环境对髓核间质干细胞及脂肪间质干细胞生物学行为的影响。方法从健康雄性大鼠腹股沟中提取的脂肪问质干细胞和尾椎间盘提取的髓核间质干细胞分别于四种不同的pH条件下进行培养：标准条件（pR7．4），模... 详细信息

目的体外模拟退变椎间盘的酸性微环境对髓核间质干细胞及脂肪间质干细胞生物学行为的影响。方法从健康雄性大鼠腹股沟中提取的脂肪问质干细胞和尾椎间盘提取的髓核间质干细胞分别于四种不同的pH条件下进行培养：标准条件（pR7．4），模拟正常、轻度退变和重度退变的椎间盘微环境（pH分别为7．1、6．8和6．5）。采用流式AV／PI染色和CCK-8测定细胞存活和增殖，实时定量PCR和WesternBlot测定聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase．2，MMP-2）、IV型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-4，ADAMTS4）和组织金属蛋白酶抑制因子3（tissue inhibitor of metalloproteinase．3，TIMP-3）的基因和蛋白表达水平。结果两种干细胞的凋亡和坏死细胞比例在酸性培养条件下均出现上升，其中髓核间质干细胞的凋亡及坏死细胞比例低于脂肪间质干细胞。两种干细胞在酸性条件下培养3--5d增殖水平均出现下降。在相同的酸性培养条件下，髓核间质干细胞的增殖水平高于脂肪间质干细胞（P均〈O．05）。随着培养基pH值下降，两种干细胞的聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和TIMP-3的mRNA和蛋白表达水平均下降，而MMP-2和ADAMTS4上升。同等培养条件下髓核间质干细胞中聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA和蛋白表达水平高于脂肪间质干细胞，而Ⅰ型胶原、MMP-2和ADAMTS4低于脂肪间质干细胞。结论退变椎间盘酸性微环境对脂肪间质干细胞和髓核问质干细胞的细胞存活和增殖能力有抑制作用，对髓核间质干细胞的抑制作用较弱。

关键词：椎间盘退行性变间质干细胞细胞增殖