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Screening and identification of Shigella flexneri 2a virulence-related genes induced after invasion of epithelial cells

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Science China(Life Sciences) 2004年第6期47卷 494-502页

作者： SHI Zhaoxing WANG Hengliang HU Kun feng erling YAO Xiao HUANG Liuyu SU Guofu HUNAG Peitang HUANG Cuifen Beijing Institute of Biotechnology Beijing 100071China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China College of Life Science Shandong Normal UniversityJinan 250014China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China College of Environmental and Chemical Engineering Xi'an Jiaotong UniversityXi'an 710049China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China Beijing Institute of BiotechnologyBeijing 100071China

An in vivo expression technology (IVET) was applied to screen *** 2a genes induced after invasion of epithelial cells, and virulence-related genes were further identified by mutational analysis. Thirteen intracellular induced genes were identified with a HeLa cell infection model. Of these, two were identified as alkylation-related genes; one was related to metabolism; one encoded a transcriptional regulator; three were identified as insertion elements; three ap- peared to be antisense to genes involved in the transmethylation,biosyntheseis, and phos- photransferase system;and three were predicted to encode polypeptides with unknown functions. Intracellular survival assavs showed that the mutants of alkA,citC and wcaJ genes had lower capability of intracellular replication or survival than the the wild-type *** results indicated that alkA, citC and wcaJ genes could take part in the intracellular survival or replication of S. flexneri 2a and the capability of intracellular survival or replication could be one of the major virulence elements. However, the yaiC mutant was able to survive in the murine infection assay but almost not in HeLa cell infection assay. Very possibly, yaiC gene was involved in the other mechanism of S. flexneri virulence. This study might lead to a better understanding of the intra- cellular survival or proliferation process of S. flexneri 2a and perhaps provide insights into the pathogenicity of this pathogen.

关键词： Shigella flexneri 2a intracellular induced expression virulence-related genes in vivo expression technology.

密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

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遗传 2015年第5期37卷 487-493页

作者：徐苹杨晶陆丽兰冯尔玲王恒樑卢瑛朱力上海海洋大学食品学院上海201306 军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

密度感应系统调节细菌应答反应的发生,这些应答反应与细胞密度有关。通过对比大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella spp.)的序列发现,志贺菌属密度感应系统操纵子普遍存在丢失或突变。为研究其密度感应系统的功能,文章利用哈... 详细信息

密度感应系统调节细菌应答反应的发生,这些应答反应与细胞密度有关。通过对比大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella spp.)的序列发现,志贺菌属密度感应系统操纵子普遍存在丢失或突变。为研究其密度感应系统的功能,文章利用哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170作为指示菌,检测弗氏志贺菌(Shigella flexneri)密度感应系统信号分子AI-2,证明其可以分泌有活性的AI-2;其次,采用Golden Gate克隆法将大肠杆菌MG1655的密度感应系统基因克隆至弗氏志贺菌301中,获得密度感应系统回复株301。通过菌落计数表明,在混合培养条件下,密度感应系统基因回复株301比野生株301存在生长优势;通过双向电泳初步比较分析表明,密度感应系统基因可以在志贺菌中表达,并鉴定到了其他一些与应激反应相关的差异表达蛋白,如Hsp60、Gro EL、Sod B。

关键词：弗氏志贺菌密度感应系统信号分子AI-2 比较蛋白质组学

生物法合成伤寒O-糖蛋白结合疫苗及其免疫原性评估

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遗传 2015年第5期37卷 473-479页

作者：彭哲慧潘超孙鹏冯尔玲吴军朱力彭清忠王恒樑吉首大学生物资源与环境科学学院湖南吉首416000 军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

伤寒由伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)引发,至今在发展中国家仍是备受关注的重要公共卫生问题。文章通过敲除伤寒菌脂多糖合成途径中O-抗原连接酶基因,转入含脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)蛋白糖基化途径中糖基转移酶的表达... 详细信息

伤寒由伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)引发,至今在发展中国家仍是备受关注的重要公共卫生问题。文章通过敲除伤寒菌脂多糖合成途径中O-抗原连接酶基因,转入含脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)蛋白糖基化途径中糖基转移酶的表达载体,以及改构的重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)外毒素A(r EPAN29)的表达载体,使细胞内能够诱导合成以伤寒O特异性多糖(O-specific polysaccharides,OPS)为目标抗原、以r EPAN29为载体蛋白的伤寒OPS-r EPAN29糖蛋白复合物,并对纯化所得复合物进行了免疫原性评价。ELISA测定血清抗体滴度表明,r EPAN29作为载体蛋白能有效增加糖链的免疫原性,糖蛋白比单独的多糖能诱导产生更好的免疫应答;3次免疫、间隔3周比间隔2周Ig G滴度稍有提高;而免疫过量的糖蛋白,抗O-多糖的血清抗体效价并无提升。文章为生物法制备多糖-蛋白结合疫苗提供了新思路,理论上也适用于其他革兰氏阴性菌的疫苗研发。

关键词：结合疫苗伤寒沙门氏菌合成生物学重组EpA O-多糖抗原

O2血清型肺炎克雷伯氏菌多糖结合疫苗的生物合成

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生物工程学报 2020年第9期36卷 1899-1907页

作者：张璐璐潘超冯尔玲华孝挺俞云松王恒樑朱力军事科学院军事医学研究院生物工程研究所北京100071 浙江大学医学院附属邵逸夫医院浙江省微生物技术与生物信息研究重点实验室浙江杭州310016

本研究旨在利用微生物体内合成肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)多糖结合疫苗并研究其保护效果。通过敲除Kp O抗原连接酶基因waaL阻断其LPS合成,再向缺失株中导入糖基工程载体,使细菌能够在体内合成糖蛋白,并将该糖蛋白免疫小... 详细信息

本研究旨在利用微生物体内合成肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)多糖结合疫苗并研究其保护效果。通过敲除Kp O抗原连接酶基因waaL阻断其LPS合成,再向缺失株中导入糖基工程载体,使细菌能够在体内合成糖蛋白,并将该糖蛋白免疫小鼠后评价其保护效果。结果表明,在构建的KpwaaL缺失株中导入糖基工程载体后,底物蛋白重组霍乱毒素B亚单位rCTB (Recombinant cholera toxin B subunit)能够被O糖化,从而得到糖蛋白;动物实验结果显示该疫苗能刺激小鼠产生较高的抗体效价,试验组小鼠攻毒后一周存活率可达75%。这种生物合成方法制备的多糖结合疫苗有望成为针对肺炎克雷伯氏菌的新型候选疫苗。

关键词：肺炎克雷伯氏菌生物合成 O-糖基化多糖结合疫苗免疫评价

福氏2a志贺氏菌2457T HtpG蛋白诱导小鼠炎性反应

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微生物学报 2008年第7期48卷 905-910页

作者：卜歆朱力刘先凯赵格冯尔玲张静飞袁静王恒樑西北农林科技大学食品科学与工程学院杨凌712100 军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

【目的】构建福氏2a志贺氏菌2457T株的htpG缺失突变株和回复株,对HtpG蛋白的功能进行初步研究。【方法】采用λ-Red重组系统对htpG基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌2457T株的htpG缺失突变株,并利用低拷贝质粒构建了htpG突变株的... 详细信息

【目的】构建福氏2a志贺氏菌2457T株的htpG缺失突变株和回复株,对HtpG蛋白的功能进行初步研究。【方法】采用λ-Red重组系统对htpG基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌2457T株的htpG缺失突变株,并利用低拷贝质粒构建了htpG突变株的回复株。在此基础上,对野生株、突变株和回复株的生长曲线、生化反应、豚鼠角膜试验进行了比较分析,并考察了野生株、突变株和回复株腹腔注射引起小鼠炎症反应的强弱。【结果】HtpG蛋白功能与福氏志贺氏菌的基本生化代谢无关,也不影响细菌穿透上皮细胞的能力,但腹腔注射后能够引起小鼠强烈的炎症反应。【结论】HtpG蛋白功能可能与细菌的免疫致病性相关。

关键词：福氏2a志贺氏菌2457T株热休克蛋白HtpG 缺失突变株炎症因子

炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株构建

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微生物学报 2009年第1期49卷 23-31页

作者：高美琴刘先凯冯尔玲唐恒明朱力陈福生王恒樑华中农业大学食品科技学院武汉430070 军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

【目的】构建炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为研究eag基因的功能奠定了基础。【方法】本研究以我国人用炭疽杆菌活疫苗A16R株中eag基因为目的缺失基因,根据炭疽芽孢杆菌Ames株基因组序列,利用软件设计了扩增上下游同源臂以及抗... 详细信息

【目的】构建炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为研究eag基因的功能奠定了基础。【方法】本研究以我国人用炭疽杆菌活疫苗A16R株中eag基因为目的缺失基因,根据炭疽芽孢杆菌Ames株基因组序列,利用软件设计了扩增上下游同源臂以及抗性基因引物,构建了重组质粒,将该重组质粒电击转入炭疽杆菌A16R感受态细胞中,利用同源重组原理筛选到炭疽杆菌A16R株eag基因缺失突变株。在分子水平及蛋白质组学方面对基因缺失突变株进行验证。【结果】成功构建了重组质粒,经同源重组后获得eag基因缺失突变株。PCR鉴定表明目的基因已经丢失;SDS PAGE表明野生株与突变株在93 kDa处有差异蛋白条带,经质谱鉴定分析该条带为目的基因所表达的EA1蛋白;双向电泳结果显示突变株与野生株比较明显缺失3个蛋白点,经质谱分析后确定这3个点都是EA1蛋白。【结论】成功获得炭疽芽孢杆菌A16R株eag基因缺失突变株,为深入研究eag基因的功能奠定了基础,同时也为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立了一个良好的技术平台。

关键词：炭疽芽孢杆菌A16R株同源重组缺失突变体双向电泳

Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究

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微生物学报 2003年第6期43卷 740-746页

作者：胡堃史兆兴王恒樑冯尔玲黄留玉军事医学科学院生物工程研究所

利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术 ,最近发展较快 ,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例 ,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌 ,除dam基因外 ,其余 3个基因均能... 详细信息

利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术 ,最近发展较快 ,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例 ,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌 ,除dam基因外 ,其余 3个基因均能被有效敲除 ,而在痢疾杆菌中只能敲除一个alkA基因。结果表明 ,为使该系统能有效地应用于痢疾杆菌和其它细菌 ,还需对该系统进行改进。

关键词： Red系统基因敲除突变体重组系统痢疾杆菌

质粒拷贝数对宋内氏菌I相O-抗原表达的影响

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生物技术通讯 2000年第3期11卷 202-205页

作者：冯尔玲王恒樑林云廖翔苏国富军事医学科学院生物工程研究所北京100071 海军医学研究所上海200433

试图通过提高质粒拷贝数来提高宋内I相O 抗原的表达水平 ,先将宋内I相O 抗原基因亚克隆至高拷贝的pUC18和pGEM3Z ,但没能找到相应的阳性转化子 ,可能O 抗原基因在高拷贝质粒上表达水平太高对宿主产生毒性效应。再将其亚克隆至中等拷贝的... 详细信息

试图通过提高质粒拷贝数来提高宋内I相O 抗原的表达水平 ,先将宋内I相O 抗原基因亚克隆至高拷贝的pUC18和pGEM3Z ,但没能找到相应的阳性转化子 ,可能O 抗原基因在高拷贝质粒上表达水平太高对宿主产生毒性效应。再将其亚克隆至中等拷贝的pAT15 3,虽能找到阳性转化子 ,但表达水平仍不能满足以后实验的需要 ,表明质粒拷贝数与I相O 抗原的表达水平密切相关 ,要有效地表达宋内I相O 抗原。

关键词：宋内氏菌高拷贝质粒宋内I相O-抗原基因表达

PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中的功能研究

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遗传 2015年第5期37卷 494-498页

作者：贾晓琳王东澍高志奇冯尔玲郑继平王恒樑郭桂英刘先凯海南大学热带生物资源教育部重点实验室海口570228 军事医学科学院生物工程研究所北京100071 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室省部共建国家重点实验培育基地海口570228

炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(***)和苏云金芽胞杆菌(***)均属于蜡样芽胞杆菌群,在遗传学上有很高的相似性。PlcR(Phospholipase C regulator)在蜡样芽胞杆菌中是十分重要的调控因子,但plc R基因在炭疽芽胞杆菌中发... 详细信息

炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(***)和苏云金芽胞杆菌(***)均属于蜡样芽胞杆菌群,在遗传学上有很高的相似性。PlcR(Phospholipase C regulator)在蜡样芽胞杆菌中是十分重要的调控因子,但plc R基因在炭疽芽胞杆菌中发生一个无义突变导致在炭疽芽胞杆菌中产生一个截短Plc R蛋白。为了研究plc R基因对炭疽芽胞杆菌功能的影响,文章以蜡样芽胞杆菌CMCC6330基因组为模板,构建重组表达质粒p BE2A-plc R后导入炭疽芽胞杆菌疫苗株A16R中获得重组菌株,对其进行表型分析。结果显示,炭疽芽胞杆菌重组菌株的溶血活性基本没有恢复,但恢复了部分神经鞘磷脂酶活性,表明将蜡样芽胞杆菌的plc R基因导入炭疽芽胞杆菌后,可以直接激活神经鞘磷脂酶活性。

关键词：蜡样芽胞杆菌 plcR 炭疽芽胞杆菌神经鞘磷脂酶溶血素