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Construction and expression of a Rev-dependent TNF-R1 expressing HIV-infected-cell injurious vectors

Chinese Medical Journal 2005年第24期118卷 2063-2071页

作者： SHI Wei-min Dean Baylis damian purcell Paul U Cameron Department of Dermatology and Venereology Tongji HospitalTongji University Shanghai 200065 China Department of Microbiology and Immunology University ofMelbourne Parkville Victoria 3052 Australia

Background Rev is necessary for exporting unspliced and incompletely spliced intron containing HIV mRNAs and for HIV replication. The aim of this study is to develop a kind of selective suicide construct that can specifically and directly induce HIV infected cells into apoptosis based on the high affinity of Rev and Rev response element （RRE）. Methods Molecular-cloning technique was used to synthesis Rev dependent TNF-R1 expression construct pDM128-TNF-R1 （pT128） that contains RRE and TNFR1 gene. Restriction digestion, Polymerase Chain Reaction （PCR） and DNA sequencing were processed and the exactness and correctness of the inserted TNF-R1 gene in pT128 were confirmed repeatedly. The expression of pT128 co-transfected with different combination of other plasmids by calcium phosphate-DNA co-precipitation in Helas and by gene gun transfection in keratinocytes was further tested by flow-cytometry and cell counted under microscope. Results The new plasmid specifically expressed TNF-R1 in Helas when co-transfected with pRev but did not when without pRev. Indirect expression of TNF-R1 from pT128 was slower than the direct expression of that from Hu p60 TNFR1 in pDC302 （pT60） , but all those pT60 or pT128 transfected cells showed apoptosis at last while TNF-R1 was sufficiently expressed. Other kinds of Rev expression construct such as pAD8 and a chimeric HIV vaccine also can switched on the selective expression of pT128. Not only Rev-dependent expression in Helas, pT128 also normally expressed its TNF-R1 in keratinocytes. Co-transfected with prey or pAD8 that expressed Rev, pT128 expressed TNF-R1 and induced apoptosis of green fluorescent keratinocytes in skin explant. The number of green fluorescent keratinocytes co-transfected by pT128 plus prey or pAD8 was gradually outnumbered by that co-transfected by pT128 only. The difference was more significant after culturing for 72 hours. Conclusions Rev dependent pT128 is able to selectively induce apoptosis of HIV-infect

关键词： human immunodeficiency virus tumor necrosis factor receptor apoptosis vaccine

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以Rev依赖性凋亡增强HIV-1 gp160的抗原性

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第4期23卷 257-261页

作者：施伟民 Paul UCameron damian JF purcell 同济大学附属同济医院皮肤科 Microbiology and Immunology Department of the Melbourne University Macfalane Burnet Centre for Medical Research

目的　检测Rev(HIV的调控基因 )依赖性肿瘤坏死因子受体 (TNFR 1)和gp16 0双重表达质粒pDM12 8 TNFR 1(pT12 8)的凋亡诱导功能。方法　采用基因枪转导及流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果　新结构具有特异的选择性表达作用。当Rev... 详细信息

目的　检测Rev(HIV的调控基因 )依赖性肿瘤坏死因子受体 (TNFR 1)和gp16 0双重表达质粒pDM12 8 TNFR 1(pT12 8)的凋亡诱导功能。方法　采用基因枪转导及流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果　新结构具有特异的选择性表达作用。当Rev存在时 ,能间接表达TNFR 1,明显诱导HeLa细胞凋亡 ,使绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P 0 .0 1)。单纯pT12 8不能直接表达TNFR 1,绿荧光细胞百分率非常显著地高于单纯pT6 0转染组 (P0 .0 1)。当AD8或pMD +pRnv存在并表达Rev时 ,pT12 8均能表达TNFR 1,杀伤HeLa细胞 ,绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P <0 .0 1)。pT12 8与pRev或AD8转染人正常的角质生成细胞时 ,能表达TNFR 1,诱导细胞凋亡。培养 72h后 ,阴性对照和单纯pT12 8组的绿荧光角质生成细胞数皆显著地超过pT12 8+pRev和pT12 8+pAD8组 (P <0 .0 1)。结论　pT12

关键词： Rev依赖性凋亡 HIV-1gp160 抗原性肿瘤坏死因子受体-l 基因枪流式细胞仪

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朗格汉斯细胞特异性递呈在巨噬细胞亲和性人类免疫缺陷病毒感染中的作用

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中华医学杂志 2003年第16期83卷 1442-1446页

作者：施伟民 Paul U Cameron damian JF purcell 同济大学附属同济医院中心实验室上海200065 Microbiology and immunology department of the Melbourne University Macfalane Burnet centre for medical research

目的　观察巨噬细胞亲和性HIV经皮肤感染的细胞学机制 ,区别巨噬细胞亲和性及T细胞亲和性HIV感染的差异。方法　以基因枪转染AD8及NL4 3分子克隆至皮肤 ,流式细胞仪和荧光显微镜观察病毒在表皮细胞中的表达 ,磁分离术分离CD80 + 和CD80 ... 详细信息

目的　观察巨噬细胞亲和性HIV经皮肤感染的细胞学机制 ,区别巨噬细胞亲和性及T细胞亲和性HIV感染的差异。方法　以基因枪转染AD8及NL4 3分子克隆至皮肤 ,流式细胞仪和荧光显微镜观察病毒在表皮细胞中的表达 ,磁分离术分离CD80 + 和CD80 -的游离细胞 ,进而以PCR和逆转录酶检测游走细胞中HIV对CD+ 4 T淋巴细胞的感染和表达。结果　AD8及NL4 3经基因枪直接转染皮肤后 ,表皮游走细胞皆显示HIV转染 ,可扩增到gag基因。只有AD8转染的游走细胞能进一步感染CD4 + T淋巴细胞 ,CD4 + T淋巴细胞可扩增到gag并表达逆转录酶 ;含NL4 3的游走细胞 ,不能感染CD4 + T淋巴细胞 ,不能扩增到gag,不能表达逆转录酶。AD8转染的 1/ 2log稀释的CD80 + 细胞能够感染CD4 + T淋巴细胞。即使 4次稀释后 ,仍能感染CD4 + T细胞 ,PCR扩增到gag并有大量逆转录酶表达 ,超过对照组的 2～ 3倍。AD8转染的CD80 -细胞仅第 1次稀释与CD4 + T细胞共孵可扩增到gag,仍可见逆转录酶表达。进一步稀释后不能扩增到gag。NL4 3转染的CD80 + 或CD80 -游走细胞与CD4 + T细胞共孵 ,皆不能扩增到gag ,也无逆转录酶表达。结论　直接转染AD8的CD80 + 的游走表皮细胞能特异性地感染CD4 + T细胞。这种特异性不仅依赖于细胞表面HIV受体的亲和性结合 ,还依赖于转?

关键词：朗格汉斯细胞特异性递呈巨噬细胞亲和性人类免疫缺陷病毒感染作用

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Rev依赖性人类免疫缺陷病毒检测结构的合成与表达

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上海医学 2003年第S1期26卷 30-33页

作者：施伟民 Paul U Cameron damian JF purcell 同济大学附属同济医院皮肤科上海200065 Department of Microbiology and Immunology Melbourne University Macfalane Burnet Centre for Medical Research

目的　利用人类免疫缺陷病毒 (HIV)低变异的调节蛋白Rev与Rev反应区 (RRE)的高亲和性 ,尝试合成一种不受变异影响的特异性病毒表达检测结构。方法　采用分子克隆技术合成含有RRE和增强的绿荧光蛋白 (EGFP)的Rev依赖性荧光表达质粒 ,采... 详细信息

目的　利用人类免疫缺陷病毒 (HIV)低变异的调节蛋白Rev与Rev反应区 (RRE)的高亲和性 ,尝试合成一种不受变异影响的特异性病毒表达检测结构。方法　采用分子克隆技术合成含有RRE和增强的绿荧光蛋白 (EGFP)的Rev依赖性荧光表达质粒 ,采用流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果　新合成的质粒pDM 12 8 EGFP (pE12 8)含氨苄青霉素受体 (AmpR)选择子、SV40 启动子、EGFP基因及HIV 1 RRE片段 ,BssSI酶切后产生 3 .6、1.9和 1.5kb片断 ,HindⅢ酶切后产生 3 470、2 72 5和 879bp 3个片断 ,PCR扩增提示EGFP基因完整插入。pE12 8在Hela细胞中显示Rev依赖性表达 ,pRev不存在时 ,几乎没有EGFP表达 ;pRev存在时 ,EGFP显著表达 (P <0 .0 1)。绿荧光Hela细胞百分比随pRev比例的增加而渐次增加。结论　pE12 8能特异、敏感、快速和直观地检测HIV的表达 ,对反映HIV的感染性及病情的转归及对获得性免疫缺陷综合征 (AIDS)

关键词： RNA结合蛋白 Rev反应区绿荧光蛋白分子克隆流式细胞仪

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带绿荧光蛋白的人类免疫缺陷病毒被膜蛋白gp160的表达

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中华传染病杂志 2004年第5期22卷 341-343页

作者：施伟民 Paul U Cameron damian JF purcell 同济大学附属同济医院皮肤科上海200065 Australia Microbiology and Immunology Department of The Melbourne University Australia

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)被膜蛋白Env是HIV感染和HIV免疫研究中的一个重要部分[1],通过表达前体蛋白gp160,经蛋白酶裂解形成Env蛋白的膜外部分gp120和跨膜部分gp41.随着分子克隆技术的应用,已有许多gp160和gp120表达结构被合成.但需... 详细信息

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)被膜蛋白Env是HIV感染和HIV免疫研究中的一个重要部分[1],通过表达前体蛋白gp160,经蛋白酶裂解形成Env蛋白的膜外部分gp120和跨膜部分gp41.随着分子克隆技术的应用,已有许多gp160和gp120表达结构被合成.但需要特殊的标记技术才能快速、敏感、特异和直观地反映Env成分的表达.本研究旨在结合增强的绿荧光蛋白(EGFP)的荧光表达[2],尝试合成适合于定性、定量和定位测定的gp160表达结构。

关键词：带绿荧光蛋白人类免疫缺陷病毒被膜蛋白 gp160 表达

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人类免疫缺陷病毒感染细胞的Rer蛋白依赖性凋亡引导

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临床皮肤科杂志 2003年第4期32卷 184-187页

作者：施伟民 Paul U Cameron damian JF purcell 上海同济大学附属同济医院皮肤科上海200065 Microbiology and Immunology Department of The Melbourne University Macfalane Burnet Centre for Medical Research

目的:以人类免疫缺陷病毒(HIV)调节蛋白Rev与Rev反应区(RRE)的高亲和性建立引导HIV感染细胞凋亡的结构。方法:用分子克隆技术合成含RRE和肿瘤坏死因子受体-1(TNF-R1)的Rev依赖性凋亡引导质粒,流式细胞仪检测质粒表达。结果:新质粒pDM128... 详细信息

目的:以人类免疫缺陷病毒(HIV)调节蛋白Rev与Rev反应区(RRE)的高亲和性建立引导HIV感染细胞凋亡的结构。方法:用分子克隆技术合成含RRE和肿瘤坏死因子受体-1(TNF-R1)的Rev依赖性凋亡引导质粒,流式细胞仪检测质粒表达。结果:新质粒pDM128-TNF-R1(pT128)HindIII内切有3.1、2.7、1.0和0.87kb片段;聚合酶链反应(PCR)法检测示TNF-R1的1360bp片段。DNA测序法确认其准确性。单纯Hup60TNF-R1在pDC302(pT60)转染Hela,TNF-R1表达可明显杀伤Hela(P0.01)。单纯Rev不杀伤Hela(P>0.01)。pT128与pRev共转,TNF-R1表达较pT60慢(P<0.01),40h后才接近单纯pT60。结论:新质粒具有Rev依赖性表达作用,进而引导Rev表达细胞凋亡。

关键词： HIV 调节蛋白Rev Rev反应区肿瘤坏死因子-1 分子克隆流式细胞仪

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The effect of specific virus delivering of Langerhan cell on the M- tropic HIV infection

The effect of specific virus delivering of Langerhan cell on...

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International Forum 2003 Academic Conference of Dermatology of the Integration of TCM with Western Medicine

作者： Shi Weimin , Panl U Cameron , damian Jf purcell. Lab Center , Tong Ji Hospital , Tong Ji University, Shanghai 200065, China

Objective:To observe the cellular mechanism of via skin infection ofMicrophage tropic (M-tropic) HIV and further differentiate the infection ofM-tropic and T-tropic HIV. Methods:DNA clone of AD8 and NL43 was respectively transfected toskin by Gene Gun, The expression of virus in the skin explants was ob-served by flow-cytometry and fluoroscope. Emigrating cells were Mac-sort-ed into CD80+ and CD80-. CD4+T lymphocytes infected by HIV from em-igrating cells were further assessed by PCR and RT assay. Results:Through direct transfection of skin by Gene Gun, emigrating

关键词： Langerhan cell Macrophage tropic T lymphocyte tropic Gene gun Flow cytometry Fluoroscope Mac sort PCR RT assay

来源： cnki会议评论

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