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人lrp-cDNA全长编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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第四军医大学学报 2006年第5期27卷 385-388页

作者：宋庆贺柴玉波陈苏民陈南春黄勇代忠明第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室陕西西安710033

目的:扩增人lrp-cDNA全长编码区、并在大肠杆菌中表达和鉴定.方法:提取脂多糖刺激后HEK293细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出全长人lrp序列,将其克隆入原核表达载体pctat后转化大肠杆菌诱导表达,做SDS-PAGE分析;并用免疫印迹法鉴定6Hi... 详细信息

目的:扩增人lrp-cDNA全长编码区、并在大肠杆菌中表达和鉴定.方法:提取脂多糖刺激后HEK293细胞的总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出全长人lrp序列,将其克隆入原核表达载体pctat后转化大肠杆菌诱导表达,做SDS-PAGE分析;并用免疫印迹法鉴定6His-tat-LRG融合蛋白表达.结果:测序结果表明,获得了全长人lrp-cDNA全长编码区,其序列与GenBank已经公布的不完全一致;SDS-PAGE分析表明,6His-tat-Lrp融合蛋白在大肠杆菌中成功表达,表达量约占菌体总蛋白的17%;免疫印迹法鉴定显示,该融合蛋白可与相应抗血清产生阳性反应.结论:得到人lrp-cDNA全长编码区序列,并成功表达,为人lrp功能的深入研究奠定了基础.

关键词：脂多糖应答基因逆转录聚合酶链反应基因表达

反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用

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中国药理学与毒理学杂志 2011年第5期25卷 447-455页

作者：赵宇武军华贾培媛吴少平高珊王晨宇黄春倩王玉霞军事医学科学院毒物药物研究所北京100850 北京市疾病预防控制中心北京100031

目的研究反式激活蛋白(tat)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用。方法将tat,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了tat-ODD-EGFP融... 详细信息

目的研究反式激活蛋白(tat)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用。方法将tat,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了tat-ODD-EGFP融合蛋白基因。将该序列克隆到原核表达载体pET28a中,在BL21工程菌中进行表达,通过亲和柱层析法纯化,得到高纯度的融合蛋白。同方法制备EGFP和tat-EGFP融合蛋白作为对照。在20%O2和1%O2将融合蛋白与A549,H1299和MDA-MB-231细胞系孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性。小鼠尾静脉注射不同融合蛋白(10 ***-1),分别在注射后1,6和12 h处死动物,取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性。结果由于EGFP相对分子质量大,无法穿透细胞及组织。tat可以有效地介导tat-EGFP进入细胞和动物实体组织,其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响,而tat-ODD-EGFP进入细胞或组织后,在20%O2条件下迅速降解,但可稳定存在于1%O2细胞及组织中。结论 tat可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜。引入ODD,20%O2下融合蛋白tat-ODD-EGFP迅速降解,但可以稳定存在于1%O2细胞和组织中,说明tat-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中。

关键词：低氧依赖性降解结构 tat 增强型绿色荧光蛋白

转录反式激活蛋白转导域介导HBcAg穿透细胞膜的作用

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中华传染病杂志 2008年第6期26卷 336-340页

作者：潘庆春臧国庆余永胜汤正好张韡韩进超上海交通大学附属第六人民医院感染科 200233

目的观察蛋白转导域（PTD）-HBcAg融合蛋白的细胞膜穿透作用。方法合成转录反式激活蛋白（tat）-PTD编码序列，PCR技术扩增HBcAg全长基因，通过重叠延伸PCR片段拼接法将tat—PTD编码序列和HBcAg全长基因融合，将融合基因克隆到pMAL-c2X... 详细信息

目的观察蛋白转导域（PTD）-HBcAg融合蛋白的细胞膜穿透作用。方法合成转录反式激活蛋白（tat）-PTD编码序列，PCR技术扩增HBcAg全长基因，通过重叠延伸PCR片段拼接法将tat—PTD编码序列和HBcAg全长基因融合，将融合基因克隆到pMAL-c2X原核表达载体中。挑选测序正确的构建质粒，转化大肠埃希菌Rosetta—gami^TM2（DE3），异丙基-β—D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达，Western印迹鉴定，亲和层析纯化融合蛋白PTD-HBcAg，同样方法得到HBcAg蛋白作为对照。纯化蛋白加入细胞培养介质中，间接免疫荧光检测进入细胞内的PTD-HBcAg和HBcAg。结果大肠埃希菌中过度表达的融合蛋白可通过亲和层析纯化，Western印迹证实纯化的PTD-HBcAg和HBcAg能被HBcAg单克隆抗体识别，细胞免疫荧光检测证实PTD-HBcAg可跨膜转导入细胞内，而单独的HBcAg未能在细胞内检测到。结论融合蛋白PTD-HBcAg可在原核表达系统中高效表达、分离纯化，PTD能介导HBcAg穿透细胞膜进入细胞。

关键词：反式激活因子类转导,遗传肝炎核心抗原,乙型细胞膜

融合蛋白tat-NEP1-40对PC12细胞氧糖剥脱模型保护作用的研究

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中华临床医师杂志（电子版） 2011年第19期5卷 5583-5589页

作者：唐旭张雪霞江洪波苟兴春四川中医药高等专科学校病理学教研室四川绵阳621000 四川中医药高等专科学校基础护理学教研室四川绵阳621000 四川中医药高等专科学校药学检验系四川绵阳621000 西安医学院细胞生物学转化医学研究室

目的观察融合蛋白tat-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用。方法含80nmol/L浓度tat-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并... 详细信息

目的观察融合蛋白tat-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用。方法含80nmol/L浓度tat-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并缺糖模拟PC12细胞缺血性损伤,分别给予tat-NEP1-40、tat-β-gal及β-gal等进行处理,利用MTT比色法、FCM法及Hoechst33258染色法检测PC12细胞存活情况并计算保护率,观察tat-NEP1-40对模拟PC12细胞缺血性损伤的保护作用。结果 (1)tat-NEP1-40蛋白能跨细胞膜进入PC12细胞;(2)该蛋白具有保护作用,最大保护率为66.8%;(3)该蛋白能提高PC12细胞拟缺血损伤时的存活率,tat-NEP1-40较OGD模型组高,活细胞生存率分别为(90.05±1.83)%、(77.10±2.00)%,Ptat-NEP1-40具有细胞转导功能,对体外模拟PC12细胞缺血性损伤具有保护作用。

关键词：基因产物,tat 缺血 PC12细胞细胞凋亡 NEP1-40 蛋白转导

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破伤风被动免疫应用的误区

创伤外科杂志 2008年第6期10卷 572-573页

作者：付立君吴殿春刘有为承德市中心医院急诊科河北承德067000

破伤风是破伤风杆菌所致的急性传染病,病死率高。人工免疫是最有效的预防办法。但临床在应用破伤风被动免疫适应证上存在许多误区,一方面造成巨大医疗资源的浪费,另一方面应该应用被动免疫破伤风抗毒素(tat)或破伤风免疫球蛋白(TIG)而... 详细信息

破伤风是破伤风杆菌所致的急性传染病,病死率高。人工免疫是最有效的预防办法。但临床在应用破伤风被动免疫适应证上存在许多误区,一方面造成巨大医疗资源的浪费,另一方面应该应用被动免疫破伤风抗毒素(tat)或破伤风免疫球蛋白(TIG)而没有应用,24小时后应用被动免疫是否有效?及时应用是否就一定不患破伤风,笔者就此阐述自己的观点。

关键词：破伤风破伤风抗毒素破伤风免疫球蛋白人工免疫

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HIV-1反式激活抑制剂的研究进展

中国药物化学杂志 2008年第6期18卷 461-467,477页

作者：张传明肖志艳胡春郭宗儒沈阳药科大学制药工程学院辽宁沈阳110016 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050

转录反式激活因子(tat)在HIV-1的转录和复制过程中起着十分重要的调节作用。tat蛋白与反式激活应答区(TAR)RNA及正向转录延伸因子(P-TEFb)形成三元复合物,不仅促使转录完全,并且显著提高转录效率。tat蛋白对HIV-1转录水平的重要调控作... 详细信息

转录反式激活因子(tat)在HIV-1的转录和复制过程中起着十分重要的调节作用。tat蛋白与反式激活应答区(TAR)RNA及正向转录延伸因子(P-TEFb)形成三元复合物,不仅促使转录完全,并且显著提高转录效率。tat蛋白对HIV-1转录水平的重要调控作用及其结构的高度保守使它成为研究抗艾滋病药物的新靶点。该文将简要介绍HIV-1 tat介导的反式激活过程,并对近年报道的以TAR、tat和P-TEFb为靶点的小分子抑制剂进行综述。

关键词：构效关系人类免疫缺陷病毒1型转录反式激活因子抑制剂

破伤风抗毒素皮试及脱敏注射方法的对比性研究

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中华现代护理杂志 2010年第33期16卷 4072-4073页

作者：金友红谭萍华杨春华苏州大学附属常熟医院常熟市第一人民医院护理部215500

目的探讨破伤风抗毒素（tat）不同剂量的皮试对结果判断的影响以及2种脱敏注射法安全性的比较.方法将276例需要注射tat的病人随机分为实验组和对照组,每组138例,实验组按tat药物说明书推荐的方法,对照组按护理教科书中的常规方法.比... 详细信息

目的探讨破伤风抗毒素（tat）不同剂量的皮试对结果判断的影响以及2种脱敏注射法安全性的比较.方法将276例需要注射tat的病人随机分为实验组和对照组,每组138例,实验组按tat药物说明书推荐的方法,对照组按护理教科书中的常规方法.比较两组效果.结果实验组皮试阳性5例,对照组阳性14例,阳性率分别为3.62%和10.14%,两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）;两组脱敏注射后均无不良反应,但实验组脱敏注射每次的间隔时间为30 min,4次脱敏的总时间较对照组延长40 min.结论药物说明书推荐的皮试方法阳性率较传统方法低,可有效避免皮试的假阳性率,减少病人的痛苦,但脱敏注射时病人等待的时间长,需要护士做好相关的宣教;鉴于药物说明书的法律地位高于教科书,临床用药以遵循药物说明书为宜,建议护理教材在编著过程中,应对药典和药物说明书加以参考.

关键词：破伤风抗毒素皮试脱敏注射对比研究

小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2006年第3期22卷 371-373,376页

作者：代忠明陈苏民杜可军陈南春宋庆贺骆文静陈景元第四军医大学生物化学与分子生物学教研室第四军医大学劳动卫生与环境卫生学教研室陕西西安710032 第四军医大学劳动卫生与环境卫生学教研室

目的原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清。方法参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签(EST)序列进行拼接,预测mlrpcDNA序列。用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA... 详细信息

目的原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清。方法参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签(EST)序列进行拼接,预测mlrpcDNA序列。用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入ptat载体中,构建mlrp的原核表达载体。以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-tat-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用West-ernblot鉴定抗体的特异性。结果预测的mlrpcDNA的长度为1905bp。将克隆获得的1554bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入ptat质粒中,在大肠杆菌中表达出His-tat-mL-RP融合蛋白。以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清。结论mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础。

关键词：脂多糖应答蛋白原核表达多克隆抗体

tat- PEG-磁性纳米脂质体跨脊髓损伤大鼠血脊髓屏障的观察

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中华医学杂志 2011年第3期91卷 193-197页

作者：王春源冯世庆刘洋王汉杰梁晓飞李辉韩明远于铁强天津医科大学总医院骨科 300052

目的探讨tat-PEG-磁性纳米脂质体作为一种药物载体通过尾静脉注入跨越大鼠血脊髓屏障（BSCB）并在脊髓损伤局部聚集的情况.方法通过反向蒸发法制备新型磁性纳米脂质体,通过表面功能基团连接tat、PEG而形成tat-PEG-磁性纳米脂质体,使... 详细信息

目的探讨tat-PEG-磁性纳米脂质体作为一种药物载体通过尾静脉注入跨越大鼠血脊髓屏障（BSCB）并在脊髓损伤局部聚集的情况.方法通过反向蒸发法制备新型磁性纳米脂质体,通过表面功能基团连接tat、PEG而形成tat-PEG-磁性纳米脂质体,使其兼备跨膜功能、长循环功能及核磁活体示踪功能;36只成年Wistar大鼠以Impactor Model-Ⅱ法建立T10急性脊髓损伤模型,随机分为3组,Ⅰ组：对照组,Ⅱ组：PEG-多功能脂质体组,Ⅲ组：tat-PEG-多功能脂质体组,各组均12只.将制备出的tat-PEG-多功能脂质体,通过尾静脉注入Ⅲ组大鼠脊髓损伤模型体内,将PEG-多功能脂质体按同样剂量尾静脉注入Ⅱ组大鼠体内,Ⅰ组尾静脉注入等量生理盐水,通过核磁共振（MRI）动态观察tat-PEG-多功能脂质体在脊髓损伤局部的靶向聚集与扩散情况、通过普鲁士蓝染色、电镜观察、火焰原子吸收分光光度法检测,分析其在脊髓损伤局部的聚集情况.结果 tat-PEG-磁性纳米脂质体可以穿过BSCB聚集在脊髓损伤局部,MRI动态观察显示,这种药物载体逐渐在损伤局部浓集,主要呈现T2WI低信号.普鲁士蓝染色观察到聚集在损伤局部组织的蓝染铁颗粒,电镜进一步观察到脊髓组织神经细胞内聚集的铁颗粒,火焰原子吸收分光光度法分析显示Ⅲ组脊髓损伤局部铁元素含量相对升高,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 tat-PEG-磁性纳米脂质体作为一种新型药物载体,通过静脉途径注入体内,可以跨越BSCB聚集在脊髓损伤局部,并能将其包裹的物质释放入损伤局部的神经细胞内,可作为脊髓损伤的治疗的新思路.

关键词：脊髓损伤脂质体药物疗法