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肝细胞生长因子基因转染脂肪细胞对移植组织工程脂肪存活的影响

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第42期12卷 8206-8210页

作者：刘婕婷刘毅哈小琴解放军兰州军区兰州总医院烧伤整形科甘肃省兰州市730000 解放军兰州军区兰州总医院实验中心甘肃省兰州市730000

背景:在脂肪组织工程的研究中,若将种子细胞与支架材料复合后移植,则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪。肝细胞生长因子可以促进血管生成、减少纤维组织增生。目的:观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织... 详细信息

背景:在脂肪组织工程的研究中,若将种子细胞与支架材料复合后移植,则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪。肝细胞生长因子可以促进血管生成、减少纤维组织增生。目的:观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织工程脂肪移植存活的影响。设计、时间及地点:随机区组设计的动物实验,于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院医学科学实验中心完成。材料:纳入Wistar大鼠用于分离、培养骨髓间充质干细胞及植入细胞-支架复合物。方法:①分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞,诱导成脂,携带绿色荧光蛋白基因及肝细胞生长因子基因的重组腺病毒毒株分别转染脂肪细胞,流式细胞仪测定转染效率,应用酶联免疫吸附试验法测定培养上清中肝细胞生长因子的表达,将脂肪细胞接种于聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架。②将75只Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为3组:脂肪细胞组、Ad-肝细胞生长因子转染组及Ad-绿色荧光蛋白转染组分别将脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染肝细胞生长因子基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染绿色荧光蛋白基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物移植于大鼠腿部肌肉之间。主要观察指标:移植后3,7,14,28,60d,每组各取5只大鼠麻醉后处死,取出移植物。电镜观察;并行苏木精-伊红、油红O、Masson’s染色,观察病理改变;同时用免疫组织化学法检测组织中肝细胞生长因子表达,观察并计数血管生成。结果:①骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞胞浆内富含丰富的脂滴,重组腺病毒感染复数=100时,携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒株转染脂肪细胞效率可达64.39%。②移植3,7,14d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中肝细胞生长因子的表达高于其他组(P<0.05),且3d达到高峰。③移植3,7,14,28,60d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中血管生成高于其他组(P<0.05),且7d时血管增加的幅度最大。④移植28,60d时,Ad-肝细胞生长因子转染组坏死程度均小于其他组,电镜下脂肪细胞也多于其他组。结论:携带肝细胞生长因子基因的脂肪细胞在移植物中能够表达肝细胞生长因子,促进移植组织工程脂肪血管生成,进而促进移植组织的成活。

关键词：组织工程脂肪脂肪组织移植干细胞骨髓细胞肝细胞生长因子转染基因疗法

孕激素和脂联素分子受体3过表达对子宫内膜异位症间质细胞中ERK1/2表达及细胞侵袭性影响

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实用医学杂志 2020年第9期36卷 1187-1192页

作者：郝婷商丽红哈春芳宁夏医科大学临床医学院银川750001 宁夏医科大学总医院妇科银川750004

目的探讨过表达孕激素和脂联素分子受体3(progestin and adipoQ receptor,PAQR3)对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞中细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)表达及细胞侵袭性的影响。方法收集宁... 详细信息

目的探讨过表达孕激素和脂联素分子受体3(progestin and adipoQ receptor,PAQR3)对子宫内膜异位症在位内膜间质细胞中细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)表达及细胞侵袭性的影响。方法收集宁夏医科大学总医院妇科符合标准的子宫内膜异位症患者在位内膜10例,分离培养、鉴定原代子宫内膜异位症在位内膜间质细胞。成功构建合成过表达PAQR3重组慢病毒。测定最佳moi后转染10例子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞,设立实验组(加入重组过表达PAQR3慢病毒)、阴性对照组(仅加入慢病毒载体)、空白对照组(不添加任何试剂、同等条件处理细胞)。培养72 h后通过Western blot比较慢病毒转染前后各组ERK1/2蛋白表达情况;通过Transwell比较转染后各组细胞侵袭性的变化。结果实验组ERK1/2蛋白较阴性对照组均呈下降趋势,差异具有统计学意义(P 0.05)。实验组细胞侵袭性较阴性对照组明显受抑制,差异具有统计学意义(P 0.05)。结论过表达PAQR3下调在位内膜间质细胞中ERK1/2蛋白表达,抑制细胞增殖活性,促进内异症发生发展。

关键词：子宫内膜异位症 PAQR3 ERK1/2 细胞侵袭性

Ad-GFP修饰MSCs静脉移植在严重烫伤延迟复苏大鼠体内的定向迁移

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军事医学科学院院刊 2007年第6期31卷 521-524页

作者：王有虎哈小琴刘毅刘婕婷兰州军区兰州总医院烧伤整形科兰州730050 兰州军区兰州总医院医学实验中心兰州730050

目的：观察携带目的基因的大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）静脉移植在严重烫伤延迟复苏损伤体内的分布。方法：分离培养MSCs,用Ad-GFP转染MSCs,25只Wistar大鼠随机分为延迟复苏组（A组,10只）、即时复苏组（B组,1... 详细信息

目的：观察携带目的基因的大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）静脉移植在严重烫伤延迟复苏损伤体内的分布。方法：分离培养MSCs,用Ad-GFP转染MSCs,25只Wistar大鼠随机分为延迟复苏组（A组,10只）、即时复苏组（B组,10只）、假伤组（C组,5只）。A、B两组大鼠背部造成Ⅲ度30%烫伤,制备A组为延迟复苏模型,B组为即时复苏模型,同时制备C组为假伤模型,经股静脉移植转染Ad-GFP 48 h后的MSCs。24 h,7 d后取小肠、肝脏、肾脏、烫伤皮肤创缘等组织,快速冰冻切片,荧光显微镜下观察在体内的分布。结果：MSCs体外分离培养扩增5代,细胞数可达（1～2）×10^11个,具有多态性和贴壁生长特性,moi=100时,Ad-GFP转染MSCs效率可达86.4%。经股静脉移植24 h,在延迟复苏组烫伤皮肤组织创缘,小肠黏膜广泛可见绿色荧光,而在肝、肺等器官少见,即时复苏组荧光以烫伤皮肤创缘分布为主,小肠黏膜较少,假伤组中绿色荧光分布以肝脏为主。延迟复苏组小肠荧光强度明显强于即时复苏组和假伤组（P〈0.05）,而延迟和即时复苏组皮肤创缘荧光强度又强于假伤组（P〈0.05）。结论：导入目的基因可能不会改变MSCs归巢特性,并将为后续启动基因治疗烧伤延迟复苏后的损伤研究提供参考。

关键词：间充质干细胞 Ad-GFP 烫伤复苏术定向迁移大鼠

重组腺病毒介导的肝细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞

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中国组织工程研究与临床康复 2008年第25期12卷 4847-4850页

作者：刘婕婷刘毅哈小琴王有虎蔡黔兰州大学临床医学院甘肃省兰州市730000 解放军兰州军区兰州总医院烧伤整形种甘肃省兰州市730000 解放军兰州军区兰州总医院实验中心甘肃省兰州市730000

背景：肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成，已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗。目的：鉴于重组腺病毒的宿主范围广，探讨重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、... 详细信息

背景：肝细胞生长因子可促进血管内皮细胞增生及新生血管形成，已广泛应用于病理性瘢痕、心肌缺血等的实验性治疗。目的：鉴于重组腺病毒的宿主范围广，探讨重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞源性脂肪细胞转染效率、目的蛋白表达及细胞活性的影响。设计、时间及地点；2006—08／2007-07在解放军兰州军区兰州总医院完成的细胞对比实验。材料：清洁级2月龄Wistar大鼠25只用于制备骨髓间充质干细胞。携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株、重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子由解放军兰州军区兰州总医院博士后科研工作站哈小琴博士惠赠。方法：向体外培养至第3代的骨髓间充质干细胞中加入含地塞米松、IBMX、牛胰岛素、吲哚美辛、胎牛血清的L-DMEM进行成脂诱导。以不同感染强度的携带绿色荧光蛋白基因重组腺病毒转染诱导后的脂肪细胞。重组腺病毒介导人肝细胞生长因子以最佳感染强度转染诱导后的脂肪细胞。主要观察指标：油红。染色检测成脂情况。流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性表达，计算转染效率。ELISA法检测转染上清中肝细胞生长因子的表达，MTT法检测转染脂肪细胞的活性。结果：①骨髓间充质干细胞成脂诱导后胞质内富含橙红色的脂滴，成脂率（97-31±0．46）％。②以100pfu／cell携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒转染脂肪细胞72h后，绿色荧光蛋白表达量达高峰，此时转染效率为65．39％。③以100pfu／cell作为最佳感染强度转染脂肪细胞72h后，肝细胞生长因子的表达量为峰值。与未转染空白对照比较，转染后24，48，72，96，168h脂肪细胞活性均无明显变化（t=-0．024～0．092，P〉0．05）。结论：重组腺病毒可介导肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞，有效表达目的蛋白，且转染该基因对脂肪细胞的活性无影响。

关键词：骨髓间充质干细胞脂肪细胞重组腺病毒肝细胞生长因子转染

低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

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浙江大学学报（医学版） 2013年第6期42卷 654-659页

作者：哈小琴姜东红邓芝云董菊子赵勇彭俊华杨志华兰州军区兰州总医院检验医学中心甘肃省干细胞与基因药物重点实验室甘肃兰州730050

目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切... 详细信息

目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 moi转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为(48.93±3.86)ng/mL。结论:本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFPHIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。

关键词：低氧诱导因子一1仅遗传载体

Ad-HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应

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第四军医大学学报 2008年第4期29卷 313-316页

作者：哈小琴吕同德赵治华唐瑜昌业伟兰州军区兰州总医院医学实验中心甘肃兰州730050

目的:观察Ad-HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ细胞)的转染表达及增殖效应.方法:以不同转染强度(50,100,200moi)Ad-GFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞,感染后48h用流式细胞仪检测转染效率.并以最佳感染强度Ad-HGF转染ATⅡ细胞,ELISA方法检测转染后... 详细信息

目的:观察Ad-HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ细胞)的转染表达及增殖效应.方法:以不同转染强度(50,100,200moi)Ad-GFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞,感染后48h用流式细胞仪检测转染效率.并以最佳感染强度Ad-HGF转染ATⅡ细胞,ELISA方法检测转染后48,72h上清中HGF的表达水平.用MTT法检测表达产物对肺泡上皮细胞的效应.结果:感染强度为100moi时,对ATⅡ细胞的转染效率已达89.61%,以100moi的Ad-HGF转染6×105细胞后48,72h上清中HGF的表达分别为(249.4±1.8)ng和(168.0±26.1)ng,且表达产物对ATⅡ细胞有明显的促增殖作用.结论:Ad-HGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达,表达产物对该细胞有明显的促增殖作用.

关键词： Ad-HGF 肺泡Ⅱ型上皮细胞转染基因表达细胞增殖

肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对脂肪颗粒移植存活率的影响

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中华医学美学美容杂志 2011年第6期17卷 433-436页

作者：刘毅王有虎哈小琴刘婕婷兰州军区总医院全军烧伤整形外科中心 730050 兰州军区总医院医学实验中心 730050 兰州大学第一医院兰州大学第二医院

目的研究携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒（Ad—HGF）修饰骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠脂肪颗粒移植存活率的影响。方法用携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（Ad-GFP）、Ad—HGF转染雄性Wistar大鼠MSCs，测定转染效率与感染上清中... 详细信息

目的研究携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒（Ad—HGF）修饰骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠脂肪颗粒移植存活率的影响。方法用携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（Ad-GFP）、Ad—HGF转染雄性Wistar大鼠MSCs，测定转染效率与感染上清中肝细胞生长因子（HGF）的表达。用雌性Wistar大鼠150只，随机分为5组：空白对照组（A组）、Ad—HGF组（B组）、MSCs组（C组）、Ad—GFP感染MSCs组（D组）和Ad—HGF感染MSCs组（E组），每组30只。各组均匀振动5分钟，将颗粒脂肪移植于自体背部皮下；移植后3、5、7、14、28、60d，每组各取5只大鼠脱颈处死，取出移植物；测体积、HE、Masson染色观察病理改变，免疫组织化学法测定组织中HGF表达和血管生成。结果积分吸光度＝100时，Ad—GFP转染MSCs效率可达89．6％；移植后3、5、7、14d，E组移植物中HGF的表达高于其他各组（P〈0．05）；移植后5、7、14、28、60d，E组血管数量也多于其他各组（P〈0．05）；28d和60d时，E组脂肪颗粒体积保持率明显好于其他4组（P〈0．05）。结论携带HGF基因的MSCs在移植物中能够持续表达HGF，有效地减少脂肪颗粒移植后的吸收，从而提高移植颗粒脂肪的存活率。

关键词：脂肪颗粒,自体骨髓间充质干细胞肝细胞生长因子转染基因治疗

鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号对老年脐静脉内皮细胞增殖及迁移能力的影响研究

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西北国防医学杂志 2019年第5期40卷 265-270页

作者：高瞻哈小琴王娟杨志华宋月娟冯强生解放军联勤保障部队第940医院甘肃兰州730050 淄博市中心医院检验科

目的:探讨鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPK1)及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)对老年脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法:通过实验确定pLKO.1-shSPK1-GFP干涉慢病毒及pPIG-U6-Scramble-GFP对照慢病毒的最佳感染复数(multiplicity of infection,moi),并用最佳moi感染HUVECs。48 h后提取细胞的蛋白质及RNA,蛋白免疫印迹法(western blot,WB)及实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测HUVECs内SPK1的蛋白和基因表达水平。用SPK1干涉慢病毒及对照病毒或S1P处理HUVECs,细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCKit-8)检测细胞的增殖能力,Transwell检测细胞的迁移能力。结果:用最佳感染复数20 moi的慢病毒感染HUVECs 48 h后,其SPK1的蛋白和基因表达水平均显著下调50%左右(P<0.01或P<0.05)。CCKit-8增殖实验及Transwell迁移实验表明,干涉SPK1可以显著抑制HUVECs的增殖及迁移能力(P<0.01)。而100 nM及200 nM S1P则可以显著促进HUVECs的增殖及迁移能力(P<0.01)。结论:HUVECs内SPK1表达水平的下降可以显著抑制HUVECs的增殖及迁移能力,而其催化产物S1P则可以促进HUVECs的增殖及迁移能力。

关键词：鞘氨醇激酶1 1-磷酸鞘氨醇细胞增殖细胞迁移

肝细胞生长因子对人脐带间充质干细胞增殖、黏附及迁移影响的体外研究

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解放军医药杂志 2014年第10期26卷 39-43页

作者：王晓辉罗芸唐瑜杨霄鹏哈小琴兰州军区兰州总医院医学实验科甘肃省干细胞与基因药物重点实验室兰州730050 兰州军区兰州总医院干部病房三科兰州730050

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)增殖、黏附及迁移能力的影响。方法按照不同腺病毒感染hUCMSCs分为实验组(Ad-GFP-HGF)和对照组(Ad-GFP)。以最佳感染复数转染hUCMSCs,观察细胞形态变化以及GFP蛋白的表达。比... 详细信息

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)增殖、黏附及迁移能力的影响。方法按照不同腺病毒感染hUCMSCs分为实验组(Ad-GFP-HGF)和对照组(Ad-GFP)。以最佳感染复数转染hUCMSCs,观察细胞形态变化以及GFP蛋白的表达。比较各组细胞增殖能力、黏附能力及迁移能力。Western Bolt检测各组细胞HGF的表达水平。结果对照组和实验组均出现了GFP的表达,实验组hUCMSCs的增殖、黏附及迁移能力均较对照组增强(P<0.05)。实验组细胞HGF的表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论 HGF的高表达能明显促进hUCMSCs的增殖、黏附和迁移。

关键词：间质干细胞肝细胞生长因子细胞增殖细胞黏附细胞运动