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Research on the Construction and Function of a Chlorophyll Degradation Recombinant Engineering Strain

Agricultural Science & Technology 2017年第10期18卷 1788-1794页

作者： zongcan yang Zhan ZHANG Jianbin YE Yufu PENG Xiangzhen LIU Hongxia WANG Technology Center China Tobacco Henan Industrial Co. Ltd. School of Food and Biological Engineering Zhengzhou University of Light Industry

In order to effectively reduce the chlorophyll content in flue-cured tobacco, improve the overall quality of tobacco leaves, chlorophyllase gene was cloned from Arabidopsis thaliana. After the expression of the expression vector in E. coil, the recombinant engineering strain was obtained. Afterwards, IPTG （isopropy-β-D-thiogalactopyranoside）was used to induce the goal protein, and the chlorophyllase activity of the recombinant engineering strain was measured, so as to investigate its degradation effect on the chlorophyll in the extracts of tobacco leaves. The results were as follows：（1） the amplified chlorophyllase gene At- CLH1 constructed the expression vector pET28a-AtCLH1 successfully, obtaining the recombinant engineering strain; （2） induced under 30 ℃ for 22 h, the strain could well express the recombinant protein AtCLH1 with 0.5 mmol/L IPTG, and the molecular weight was about 35 kDa; （3） the strain showed good chlorophyllase producing capability, and the activity of the produced chlorophyllase could reach up to 24.9 U/mL, which could degrade the chlorophyll in tobacco extract and had a good application prospect in improving the quality of low quality tobacco; （4） based on the results of orthogonal test, the enzyme extract from the strain was added to the tobacco leaf surface, which could make the degradation rate of chlorophyll in the tobacco leaf reach 17.06% under the temperature of 37 ℃ at the humidity of 75% for 48 h; （5） after treated by the enzyme liquid, the test tobacco showed increase in the content of aromatic substances, enhancement of tobacco fragrance quality and amount, significant decrease of offensive odor and irritation, significant improvement of agreeable aftertaste, making the overall sensory quality of the tobacco leaf significantly improved.

关键词： Tobacco leaf Degradation of chlorophyll Recombinant Engineering strain Protein expression Activity of chlorophyllase Orthogonal test Aroma substances Sensory quality

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基于互联网数据的斗烟感官质量评价指标分析

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烟草科技 2021年第12期54卷 81-86页

作者：付博金一骁王剑苏凯于建军杨宗灿河南农业大学烟草学院郑州市450002 浙江中烟工业有限责任公司杭州卷烟厂杭州市310024 湖北中烟工业有限责任公司三峡卷烟厂湖北省宜昌市443100 深圳烟草工业有限责任公司广东省深圳市518110 河南中烟工业有限责任公司技术中心郑州市450016

为明确影响消费者斗烟喜爱度的感官评价指标,了解消费者选择斗烟产品的偏好,利用Python编程语言编写爬虫程序,获取斗烟产品互联网评价数据,并采用正交偏最小二乘判别和逐步回归对斗烟产品的评价数据进行分析。结果表明,对于原味型产品,... 详细信息

为明确影响消费者斗烟喜爱度的感官评价指标,了解消费者选择斗烟产品的偏好,利用Python编程语言编写爬虫程序,获取斗烟产品互联网评价数据,并采用正交偏最小二乘判别和逐步回归对斗烟产品的评价数据进行分析。结果表明,对于原味型产品,消费者的喜爱度主要基于层次变化和质地厚薄2个评价指标,其中层次变化>质地厚薄。而对于调味型产品,消费者喜爱度主要参考层次变化和室韵嗅香2个评价指标,其中层次变化>室韵嗅香。

关键词：斗烟感官质量评价网络评价正交偏最小二乘判别分析逐步回归

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陈化烟叶中1株果胶酶高产菌的分离、筛选与鉴定

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河南农业科学 2017年第2期46卷 143-147页

作者：张耀广杨宗灿刘向真杨永锋梁慎李家美河南农业大学生命科学学院河南郑州450002 河南中烟工业有限责任公司技术中心河南郑州450000 河南省农业科学院河南郑州450002

烤烟中的高果胶含量严重影响烟草吸食品质和陈化速度。为降低烟草中的果胶含量,提高烟草及烟草制品的品质及安全性,从不同年份和不同产地的18份复烤烟草中共分离筛选出有降解果胶能力的细菌38株和真菌9株。其中,XC-8、XC-30、SMXP-57、S... 详细信息

烤烟中的高果胶含量严重影响烟草吸食品质和陈化速度。为降低烟草中的果胶含量,提高烟草及烟草制品的品质及安全性,从不同年份和不同产地的18份复烤烟草中共分离筛选出有降解果胶能力的细菌38株和真菌9株。其中,XC-8、XC-30、SMXP-57、SMXP-58、SMXP-62共5株细菌具有较高的降解果胶的能力,在发酵时间24 h、发酵温度30℃、接种量10%条件下果胶酶活性分别为176、179、143、192、121 U/mL。其中,菌株SMXP-58酶活性最高(192 U/mL),通过16S r DNA序列分析并结合形态、理化特性分析,确定SMXP-58菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。将SMXP-58菌株制成的菌剂(9.6×107个/mL)喷施于100 g烟叶表面,发酵3 d的烟叶评吸总分提高了1.02,进一步优化发酵条件,在发酵时间60 h、菌液量1 mL、水量20 mL的条件下,烟叶中果胶含量最低(7.45%)。

关键词：陈化烟叶枯草芽孢杆菌果胶酶酶活性

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叶绿素降解工程菌株的构建

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河南农业科学 2017年第6期46卷 39-42页

作者：杨宗灿张展彭玉富侯佩聂聪马宇平河南中烟工业有限责任公司技术中心河南郑州450000 郑州轻工业学院食品与生物工程学院河南郑州450001

为特异、高效地降解烟叶中的叶绿素,从模式植物拟南芥中克隆获得了叶绿素酶基因At CLH1片段,大小为975 bp。通过构建表达载体p ET28a-At CLH1,并转化大肠杆菌BL21,获得了重组工程菌株。该菌株在30℃下,经0.5 mmol/L IPTG诱导培养22 h,... 详细信息

为特异、高效地降解烟叶中的叶绿素,从模式植物拟南芥中克隆获得了叶绿素酶基因At CLH1片段,大小为975 bp。通过构建表达载体p ET28a-At CLH1,并转化大肠杆菌BL21,获得了重组工程菌株。该菌株在30℃下,经0.5 mmol/L IPTG诱导培养22 h,可较好地表达重组蛋白At CLH1,蛋白质电泳图谱显示其大小约为35 ku。该菌株的叶绿素酶活力可达24.9 U/m L,能够明显降解烟叶提取物中的叶绿素,在提升低次烟叶品质方面具有很好的应用前景。

关键词：烟叶工程菌株叶绿素酶基因重组蛋白叶绿素降解

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烟叶中纤维素高效降解菌的筛选与作用效果研究

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河南农业大学学报 2018年第3期52卷 418-423页

作者：杨宗灿冯颖杰李龙飞张耀广李家美刘超河南中烟工业有限责任公司技术中心河南郑州450000 河南农业大学生命科学学院河南郑州450002

为有效降解烟叶中的纤维素,改善烟叶的整体品质,从不同产地原烟表面初步分离出具有降解纤维素能力的菌株;通过测定菌株所产纤维素酶活性,筛选高产纤维素酶菌株并进行16 S rDNA测序,结合生理生化试验对其进行鉴定;进一步采用正交试验优... 详细信息

为有效降解烟叶中的纤维素,改善烟叶的整体品质,从不同产地原烟表面初步分离出具有降解纤维素能力的菌株;通过测定菌株所产纤维素酶活性,筛选高产纤维素酶菌株并进行16 S rDNA测序,结合生理生化试验对其进行鉴定;进一步采用正交试验优化菌株在烟叶中的发酵条件,考察烟叶中纤维素降解效果。结果表明:1)在分离得到的18株菌株中,XC-19-1产纤维素酶活性最高(6.6 U·mL^(-1));2)16 S rDNA测序以及生理生化试验推断,XC-19-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);3)根据正交试验的结果,将培养后的XC-19-1菌液按照3%的烟叶质量比例施加于抽梗后的烟叶表面,在温度为37℃、相对湿度为75%的条件下作用60 h后,烟叶中的纤维素降解率可达30.6%,总糖以及还原糖含量均有明显提高,有效提升烟叶整体质量。

关键词：烟叶纤维素降解 16 S rDNA测序枯草芽孢杆菌

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一株鞘氨醇单胞菌对复烤后烟叶多酚物质的降解作用

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中国烟草学报 2019年第1期25卷 19-24页

作者：冯颖杰袁岐山杨宗灿张婷婷刘向真李成刚王二彬马胜涛张展河南中烟工业有限责任公司技术中心河南省郑州市450000

为开发促进烟叶品质改善的新型生物制剂,研究了鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. XP对降解复烤后烟叶中多酚类的作用,优化了发酵条件,并对发酵后烟叶中主要多酚物质、常规化学成分和感官质量进行了评价。结果表明:①在菌液接种量15wt%,相... 详细信息

为开发促进烟叶品质改善的新型生物制剂,研究了鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp. XP对降解复烤后烟叶中多酚类的作用,优化了发酵条件,并对发酵后烟叶中主要多酚物质、常规化学成分和感官质量进行了评价。结果表明:①在菌液接种量15wt%,相对湿度65%,30℃条件下发酵30 d,烟叶中多酚降解效果最佳;②菌株XP发酵处理对烟叶中绿原酸和芸香苷具有显著降解作用(P0.05);③经鞘氨醇单胞菌发酵处理后烟叶淀粉含量显著降低(P0.05);感官质量提高。

关键词：鞘氨醇单胞菌烟叶发酵多酚

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河南浓香型烤烟叶面不同分切区位非挥发性有机酸含量和感官质量的变化

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中国农业科技导报 2018年第12期20卷 122-129页

作者：刘超陈伟杨永锋刘向真王根发张书伟王宝林贾国涛姚倩杨宗灿河南中烟工业有限责任公司技术中心郑州450000

为进一步探索烟叶分切加工的化学物质基础,以河南浓香型初烤烟叶为材料,从叶尖到叶基分切成10段(HN-1～HN-10),利用单因素方差分析、相关回归分析研究了叶片不同分切区位非挥发性有机酸含量的变化,并基于非挥发性有机酸含量对不同区位... 详细信息

为进一步探索烟叶分切加工的化学物质基础,以河南浓香型初烤烟叶为材料,从叶尖到叶基分切成10段(HN-1～HN-10),利用单因素方差分析、相关回归分析研究了叶片不同分切区位非挥发性有机酸含量的变化,并基于非挥发性有机酸含量对不同区位进行聚类分析和感官评价。结果表明:(1)不同分切区位非挥发性有机酸总量平均为124.22 mg/g,变幅为41.70～193.40 mg/g,各组分平均含量表现为苹果酸(89.38 mg/g)>草酸(18.07 mg/g)>柠檬酸(13.48 mg/g)>丙二酸(3.13 mg/g)>丁二酸(0.17 mg/g);(2)草酸和丙二酸在不同区位间的差异达到极显著水平;(3)丙二酸、柠檬酸含量与分切区位(HN-1→HN-10)呈极显著负相关关系,草酸与分切区位呈极显著正相关关系,从叶尖到叶基,草酸含量呈逐渐增加的抛物线型变化,丙二酸和柠檬酸含量均呈逐渐降低的线性变化;(4)可将不同区位聚为两段,第一段(HN-1～HN-7)非挥发性有机酸含量为124.68 mg/g,第二段(HN-8～HN-10)含量为123.15 mg/g;(5)两段式分切烟叶样品的感官评吸结果为第一段(43.19分)>整片(42.08分)>第二段(41.04分),且第一段的得分显著高于整片和第二段,说明切除叶基3/10的烟叶有望作为高端原料的替代。

关键词：浓香型烤烟分切区位非挥发性有机酸含量聚类分析感官评价

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红茶菌发酵制备特色酸香型烟草浸膏

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食品与生物技术学报 2021年第10期40卷 104-111页

作者：叶建斌齐晓娜张婷婷孙福艳杨宗灿王高杰张展艾丹刘文召冯颖杰郑州轻工业大学食品与生物工程学院河南郑州450002 河南中烟工业有限责任公司技术中心河南郑州450016

为制备一种酸香型烟草浸膏,首先优化了烟草浸提液提取工艺,通过红茶菌发酵浸提液并浓缩获得烟草浸膏,经GC-MS分析了浸膏的香味成分,结合感官评价其在卷烟中应用效果。结果显示:提取工艺经优化后,烟草浸提液提取率和糖质量分数分别达到55... 详细信息

为制备一种酸香型烟草浸膏,首先优化了烟草浸提液提取工艺,通过红茶菌发酵浸提液并浓缩获得烟草浸膏,经GC-MS分析了浸膏的香味成分,结合感官评价其在卷烟中应用效果。结果显示:提取工艺经优化后,烟草浸提液提取率和糖质量分数分别达到55.34%、13.14 g/L;与未发酵浸膏相比,发酵烟草浸膏香味成分含量和种类均有所增加,其中苯乙酸、乳酸、3-甲基丁酸等酸性香味成分增加明显,且巨豆三烯酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、麦芽酚等烟草特征香味成分含量均有提高;发酵浸膏在卷烟中应用,可有效提高卷烟的吸食品质,香气质和香气量也明显提高,且效果优于未发酵制备的烟草浸膏。经浸提优化和生物发酵,获得了一种具有酸香特征的烟草浸膏,为制备有特征香味的烟草浸膏提供了借鉴。

关键词：红茶菌烟草发酵烟草浸膏

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烟叶中1株可高效降解淀粉的菌株筛选与作用效果研究

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河南农业科学 2018年第1期47卷 150-154页

作者：冯颖杰王鹏飞陈芝飞杨宗灿李家美张展王根发河南中烟工业有限责任公司技术中心河南郑州450000 河南农业大学生命科学学院河南郑州450002

为有效降低烟叶中的淀粉含量、提高烟叶品质,从不同产地原烟表面初步分离具有降解淀粉能力的菌株,通过测定菌株的淀粉酶活性筛选高效产淀粉酶菌株,并对筛选菌株基因组DNA进行16S rDNA测序,同时结合生理生化试验对其进行鉴定。结果表明:... 详细信息

为有效降低烟叶中的淀粉含量、提高烟叶品质,从不同产地原烟表面初步分离具有降解淀粉能力的菌株,通过测定菌株的淀粉酶活性筛选高效产淀粉酶菌株,并对筛选菌株基因组DNA进行16S rDNA测序,同时结合生理生化试验对其进行鉴定。结果表明:在分离得到的22株菌株中,XC-3菌株产淀粉酶活性最高(116 U/mL);根据其16S rDNA测序结果以及生理生化试验结果推断,XC-3为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。进一步采用正交试验优化XC-3菌株在烟叶中的发酵条件,并考察其对烟叶中淀粉的降解效果。结果显示,将培养后的XC-3菌液(OD600=2.0)按照3%的烟叶质量比例接种于抽梗后的烟叶表面,在37℃条件下发酵48 h后,烟叶中的淀粉降解率可达29.84%,烟叶的总糖、还原糖含量上升,有效提升了烟叶的整体质量。

关键词：烟叶淀粉菌株鉴定苏云金芽孢杆菌淀粉酶

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基于SNP标记的4个品种复烤烟叶鉴别研究

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河南农业科学 2023年第11期52卷 174-180页

作者：杨金初童治军李萌赵旭徐永明冯颖杰杨宗灿曲鹏李悦孙九喆张轲河南中烟工业有限责任公司技术中心河南郑州450000 云南省烟草农业科学研究院/烟草行业烟草生物技术育种重点实验室/国家烟草基因工程研究中心云南昆明650021 郑州轻工业大学食品与生物工程学院河南郑州450001 云南省烟草质量监督检测站云南昆明650106

为探究单核苷酸多态性(SNP)标记在复烤烟叶品种鉴别上的可行性,开发基于SNP标记的复烤烟叶高效鉴别技术,对4个主栽烟草品种云烟87、红花大金元、K326及NC102的复烤烟叶进行了全基因组测序,应用全基因组数据发掘SNP位点,依据SNP位点设计... 详细信息

为探究单核苷酸多态性(SNP)标记在复烤烟叶品种鉴别上的可行性,开发基于SNP标记的复烤烟叶高效鉴别技术,对4个主栽烟草品种云烟87、红花大金元、K326及NC102的复烤烟叶进行了全基因组测序,应用全基因组数据发掘SNP位点,依据SNP位点设计了PCR引物,并对不同烟草品种进行了基因分型和区分。结果显示,4个品种复烤烟叶全基因组测序共获得21.5 Gb数据,共检测出27137个SNP位点。挑选其中53个SNP位点设计不同错配类型等位基因引物570条,扩增结果均与预期一致。SNP位点35、45和51在品种间具有多态性,红花大金元在35、45、51位点基因型为T/T、C/C、T/T;K326为C/T、C/T、C/C;NC102为C/T、C/T、C/T;云烟87烟叶在35位点无扩增,在45、51位点的基因型为C/T、C/T。依据3个SNP位点的基因型构建不同品种的分子ID,可准确区分4个品种的复烤烟叶。

关键词：复烤烟叶品种鉴别全基因组测序 SNP位点等位基因多态性

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