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Development of a novel platform for recombinant protein production in Corynebacterium glutamicum on ethanol

Synthetic and Systems Biotechnology 2022年第2期7卷 765-774页

作者： Xinyu Yu Xiuxia Liu Xiong Gao Xunxun Luo Yankun Yang Ye Li Chunli Liu Chong Zhang zhonghu bai Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of EducationSchool of BiotechnologyJiangnan UniversityWuxiChina National Engineering Research Center for Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing Jiangnan UniversityWuxiChina Division of Life Science The Hong Kong University of Science and TechnologyClear Water BayHong KongChina Jiangsu Provincial Research Center for Bioactive Product Processing Technology Jiangnan UniversityWuxiChina MOE Key Laboratory for Industrial Biocatalysis Institute of Biochemical EngineeringDepartment of Chemical EngineeringTsinghua UniversityBeijingChina Center for Synthetic and Systems Biology Tsinghua UniversityBeijingChina

Corynebacterium glutamicum represents an emerging recombinant protein expression factory due to its ideal features for protein secretion,but its applicability is harmed by the lack of an autoinduction system with tight regulation and high yield.Here,we propose a new recombinant protein manufacturing platform that leverages ethanol as both a delayed carbon source and an inducer.First,we reanalysed the native inducible promoter PICL from the acetate uptake operon and found that its limited capacity is the result of the inadequate translation initial architecture.The two strategies of bicistronic design and ribozyme-based insulator can ensure the high activity of this promoter.Next,through transcriptional engineering that alters transcription factor binding sites(TFBSs)and the first transcribed sequence,the truncated promoter PA256 with a dramatically higher transcription level was generated.When producing the superfolder green fluorescent protein(sfGFP)under 1%ethanol conditions,PA256 exhibited substantially lower protein accumulation in prophase but an approximately 2.5-fold greater final yield than the strong promoter PH36.This superior expression mode was further validated using two secreted proteins,camelid antibody fragment(VHH)and endoxylanase(XynA).Furthermore,utilizing CRISPRi technology,ethanol utilization blocking strains were created,and PA256 was shown to be impaired in the phosphotransacetylase(PTA)knockdown strains,indicating that ethanol metabolism into the tricarboxylic acid cycle is required for PA256 upregulation.Finally,this platform was applied to produce the“de novo design”protein NEO-2/15,and by introducing the N-propeptide of CspB,NEO-2/15 was effectively secreted with the accumulation 281 mg/L obtained after 24 h of shake-flask fermentation.To the best of our knowledge,this is the first report of NEO-2/15 secretory overexpression.

关键词： Corynebacterium glutamicum Ethanol Transcriptional engineering Secretory protein overexpression NEO-2/15

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调控质粒拷贝数优化生物催化效率的研究进展

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食品与发酵工业 2024年第6期50卷 282-289页

作者：李业严豪刘梦婷白仲虎江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程研究院广东深圳518000

质粒作为外源基因异源表达的普遍载体,在合成生物学中广泛应用。不同质粒载体在细胞工厂中的拷贝数不尽相同,合理利用拷贝数不同的质粒可以优化目标基因表达水平,提高生物催化效率。针对天然质粒复制子系统的局限,近年来研究者们依据质... 详细信息

质粒作为外源基因异源表达的普遍载体,在合成生物学中广泛应用。不同质粒载体在细胞工厂中的拷贝数不尽相同,合理利用拷贝数不同的质粒可以优化目标基因表达水平,提高生物催化效率。针对天然质粒复制子系统的局限,近年来研究者们依据质粒复制机制,开发出了许多性能更优异的新质粒系统,显著提高了生物催化效率。该文结合质粒拷贝数在多种微生物细胞工厂中的应用进行综述,以期为合成生物学领域的相关研究提供参考和借鉴。

关键词：异源表达质粒复制子拷贝数合成生物学

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农产品稀缺线索对临期食品购买意愿的影响研究

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商业经济与管理 2024年第1期 78-91页

作者：柏忠虎青平黄帆华中农业大学经济管理学院湖北武汉430070

食物浪费是粮食安全的重要威胁因素,引起全社会的关注。临期食品丢弃是导致零售环节食物浪费的主要因素,有必要采取措施来影响和塑造消费者对临期食品的购买行为以减少浪费。文章基于稀缺效应,研究了农产品稀缺线索是否以及如何影响消... 详细信息

食物浪费是粮食安全的重要威胁因素,引起全社会的关注。临期食品丢弃是导致零售环节食物浪费的主要因素,有必要采取措施来影响和塑造消费者对临期食品的购买行为以减少浪费。文章基于稀缺效应,研究了农产品稀缺线索是否以及如何影响消费者对临期食品的购买意愿。通过两项实验发现:(1)提供(vs.不提供)与临期食品相关的农产品稀缺线索,无论是短期稀缺线索还是长期稀缺线索,都可以在同等程度上提升消费者对临期食品的购买意愿;(2)农产品长期稀缺线索(vs.无稀缺线索)对购买意愿的提升作用通过感知价值中介,农产品短期稀缺线索(vs.无稀缺线索)对购买意愿的提升作用通过感知风险中介;(3)环境卷入度调节了农产品稀缺线索对购买意愿的影响。研究结论从理论上厘清了农产品稀缺线索促进临期食品购买的机制,从实践上为促进临期食品购买和减少食物浪费提供了启示。

关键词：食物浪费粮食安全临期食品农产品稀缺线索环境卷入度

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四种过氧化物酶体同工酶在毕赤酵母甲醇代谢中的作用研究

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食品与发酵工业 2024年第3期50卷 9-15,I0001页

作者：邹潇毅王世杰杨艳坤白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),... 详细信息

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),核糖-5-磷酸异构酶2(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-2),转醛醇酶2(transaldolase,Tal1-2),果糖-1,6-二磷酸醛缩酶2(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-2)。在验证其参与甲醇代谢的基础上,分别对4个酶基因进行单敲除、四敲除,并在四敲除菌中分别进行细胞质同工酶及过氧化物酶体同工酶的回补实验。结果表明4敲除菌在甲醇培养基中受到严重的生长抑制。而单敲除菌中,Fba1-2的缺失对菌株在甲醇培养基中的生长表型影响最大;同时,回补Fba1-2也能最大程度地恢复4敲除菌株的生物量。综上,Fba1-2是甲醇同化途径中的关键酶,且同化途径的过氧化物酶体区室化对甲醇代谢途径至关重要。此外,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,Shb17)基因单敲除菌和TAL1-2基因单敲除菌的表型对比结果表明,更改的卡尔文循环是甲醇代谢中木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)再生的主要途径。该研究可为后续优化毕赤酵母甲醇利用途径提供理论依据。

关键词：毕赤酵母甲醇利用途径同化同工酶区室化木酮糖-5-磷酸

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Expi293F表达重组鲎C因子用于荧光法内毒素检测

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食品与发酵工业 2024年第2期50卷 106-111页

作者：柯文锋李诗洁郑梦林白仲虎杨艳坤江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122

鲎C因子是一种对痕量内毒素高度敏感的丝氨酸蛋白酶原,在医药行业可替代鲎试剂用于内毒素检测。然而其重组表达困难,且对于环境中内毒素的控制要求极高。该文首先克隆了来源于东方鲎的全长C因子,并在N末端和C末端分别添加了Flag标签和6... 详细信息

鲎C因子是一种对痕量内毒素高度敏感的丝氨酸蛋白酶原,在医药行业可替代鲎试剂用于内毒素检测。然而其重组表达困难,且对于环境中内毒素的控制要求极高。该文首先克隆了来源于东方鲎的全长C因子,并在N末端和C末端分别添加了Flag标签和6×His标签,同时用哺乳细胞表达载体中的分泌信号肽替换掉了原始C因子信号肽。构建好的重组质粒转染至人胚胎肾脏细胞Expi293F悬浮培养7 d后收获上清液,Western Blot检测蛋白与预测大小128 kDa一致,具有与内毒素结合以及结合后切割荧光底物的能力。该研究首次在人胚胎肾脏细胞Expi293F中成功表达出具有生物学活性的全长C因子,表达量达到19.18 mg/L,比DING在昆虫细胞SF9中的表达量提高了113%。该方法对于后续开发低成本内毒素检测试剂盒具有指导意义。

关键词：内毒素检测鲎C因子 Expi293F 重组表达脂质体转染

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恶臭假单胞菌F1表达P450酶催化柠檬烯生物合成紫苏醇

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食品与发酵工业 2024年第2期50卷 34-40页

作者：底心怡刘春立刘秀霞杨艳坤白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠... 详细信息

紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中皆可扩增并表达目的基因的广宿主载体,过表达选择性羟化酶CymAa、CymAb,异源表达特异性氧化柠檬烯生成紫苏醇的P450酶CYP153A6,并在表达P450酶的基础上对柠檬烯底物添加浓度进行了调整,与大肠杆菌BL21(DE3)一同进行柠檬烯生物合成紫苏醇实验,并使用紫外可见分光光度计和GC-MS分别测量菌株生长状况和紫苏醇产量。最终证明了恶臭假单胞菌F1在柠檬烯浓度为10 mmol/L内的环境中具有高耐受度,且添加1 mmol/L柠檬烯底物发酵48 h后获得最高产量75.6 mg/L,最高转化率达到49.66%,缩小了生物合成紫苏醇的底物添加范围,并获得对柠檬烯具有高耐受度的发酵宿主。

关键词：紫苏醇细胞色素P450 CymAab 恶臭假单胞菌广宿主载体萜类化合物耐受度

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大肠杆菌L-丝氨酸脱水酶的表达改善甘氨酸营养缺陷型毕赤酵母L-丝氨酸的生长

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食品与发酵工业 2024年第13期50卷 16-24页

作者：刘璐瑶李康王世杰白仲虎杨艳坤金坚工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心(江南大学) 江苏无锡214122 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122

氨基酸作为一种迟效碳源无法被微生物快速利用。L-丝氨酸脱水酶(L-serine dehydratase,L-SerDH)可以将L-丝氨酸一步催化为丙酮酸和氨进入中心碳代谢生成生物量,且此过程不需要消耗ATP和还原力。L-丝氨酸是甲酸利用途径(还原性甘氨酸途径... 详细信息

氨基酸作为一种迟效碳源无法被微生物快速利用。L-丝氨酸脱水酶(L-serine dehydratase,L-SerDH)可以将L-丝氨酸一步催化为丙酮酸和氨进入中心碳代谢生成生物量,且此过程不需要消耗ATP和还原力。L-丝氨酸是甲酸利用途径(还原性甘氨酸途径)的关键中间体。因此,改善L-丝氨酸的利用可以为甲酸和丝氨酸作为碳源利用提供参考价值。该文对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行了丝氨酸耐受性实验,结果显示毕赤酵母可以耐受20 g/L丝氨酸。对内源L-丝氨酸脱水酶在毕赤酵母中的表达进行了优化。在甘氨酸营养型毕赤酵母内分别表达了8种异源L-丝氨酸脱水酶,结果表示大肠杆菌tdcG基因编码的L-SerDH对丝氨酸利用改善效果最好,终OD 600提高至出发菌株的1.6倍。该研究验证了巴斯德毕赤酵母对L-丝氨酸的耐受性,并筛选得到了较优的L-丝氨酸脱水酶来源,为毕赤酵母的丝氨酸利用提供了更优的酶来源。

关键词： L-丝氨酸脱水酶巴斯德毕赤酵母丝氨酸耐受性甘氨酸营养缺陷型菌株 L-丝氨酸

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抗IL-5纳米抗体筛选及活性检测

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中国生物工程杂志 2024年第2期44卷 59-68页

作者：李诗洁代维燕王雪莲刘畅梁耀极白仲虎陈永奇江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室无锡214122 珠海瑞思普利医药科技有限公司珠海519040

白介素-5(IL-5)是一种同源二聚体细胞因子,是嗜酸性粒细胞(eosinophilic,EOS)增殖、活化和成熟的重要调节因子。抗IL-5单克隆抗体能阻断IL-5与IL-5受体亚单位α(IL-5Rα)结合,已成功用于治疗嗜酸性粒细胞哮喘。目前上市的单克隆抗体药... 详细信息

白介素-5(IL-5)是一种同源二聚体细胞因子,是嗜酸性粒细胞(eosinophilic,EOS)增殖、活化和成熟的重要调节因子。抗IL-5单克隆抗体能阻断IL-5与IL-5受体亚单位α(IL-5Rα)结合,已成功用于治疗嗜酸性粒细胞哮喘。目前上市的单克隆抗体药物需要反复注射给药,严重影响了患者的依从性,而且注射给药的全身暴露率高。为获得适合吸入给药的抗体,在羊驼天然库中通过3轮淘选,挑取单克隆通过Phage ELISA初筛,共获得461个阳性克隆,其中50个为序列独特的分子,最终选择30个分子进行重组表达纯化。通过ELISA结合、ELISA阻断、FACS阻断、TF-1增殖抑制等实验对候选抗体进行体外活性检测,成功获得一个具有阻断IL-5和IL-5Rα结合的纳米抗体AIL-A96-Fc。通过与人和猴IL-5的ELISA结合实验表明,该分子具有良好人猴交叉活性,而且在FACS阻断实验和ELISA阻断实验中,AIL-A96-Fc表现出良好的阻断效果。该开发方法不仅提供了一个靶向IL-5的候选纳米抗体AIL-A96-Fc,也为后续开发更多靶向IL-5的候选纳米抗体提供了指导意义。

关键词：白介素-5 纳米抗体阻断活性噬菌体展示哮喘

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An application of dicistronic vector for protein expression in Corynebacterium glutamicum

An application of dicistronic vector for protein expression ...

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中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议

作者： Wei Zhang Zihao Zhao Feng Peng Yankun Yang zhonghu bai Xiuxia Liu National Engineering Laboratory for Cereal Fermention Technology Jiangnan University The Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education Jiangnan University

Corynebacterium glutamicum is traditionally used in fermentation processes on amino acids production,and it is also an attractive host for the production of heterologous proteins such as industrial enzymes and pharmaceutical proteins.However,attempts to use C.glutamicum as hsot for heterologous protein production mainly focused on vector construction or promoter screening have often failed or lead to disappointing results.Moreover,few expression vectors also limited the research on

关键词： Corynebacterium glutamicum dicistronic vector translation reinitiation secretory production

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谷氨酸棒杆菌细胞工厂育种策略以及高通量筛选技术的研究进展

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食品与发酵工业 2023年第21期49卷 276-283页

作者：李业孟丽虹严豪白仲虎江南大学生物工程学院江苏无锡214122 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学) 江苏无锡214122 清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程研究院广东深圳518000

谷氨酸棒杆菌作为工业生产氨基酸及众多高附加值产品的工程菌株,是一种绿色高效的底盘微生物,已被开发为工业微生物细胞工厂。设计与构建高效工业微生物细胞工厂是绿色生物制造的重要基础,也是促进实现“碳中和”目标的重要途径之一。... 详细信息

谷氨酸棒杆菌作为工业生产氨基酸及众多高附加值产品的工程菌株,是一种绿色高效的底盘微生物,已被开发为工业微生物细胞工厂。设计与构建高效工业微生物细胞工厂是绿色生物制造的重要基础,也是促进实现“碳中和”目标的重要途径之一。微生物育种及高通量筛选技术是创制高效微生物细胞工厂和生物产业技术创新的重要方向。文章结合实际案例针对谷氨酸棒杆菌细胞工厂的育种策略和高通量筛选技术进行综述,以期为谷氨酸棒杆菌选育领域的相关研究提供参考和借鉴。

关键词：谷氨酸棒杆菌微生物细胞工厂育种高通量筛选技术

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