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畜牧兽医学报 2015年第12期46卷 2227-2234页

作者：薛晓娟金红岩赵玲娜隋修锟 zheney makay 李刚中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室/农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站北京100193

旨在以人5型复制缺陷型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒(VSV)双血清型G蛋白的重组腺病毒。利用融合PCR技术扩增VSV-IN-G-NJ-G基因并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中。通过PacⅠ酶线性化后,与同样经PacⅠ酶线性化的... 详细信息

旨在以人5型复制缺陷型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒(VSV)双血清型G蛋白的重组腺病毒。利用融合PCR技术扩增VSV-IN-G-NJ-G基因并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中。通过PacⅠ酶线性化后,与同样经PacⅠ酶线性化的骨架载体pacAd5 9.2-100共转染AAV-293细胞,获得重组腺病毒rAd-VSV-IN-G-NJ-G。该重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至20代效价稳定。经间接免疫荧光和Western blot检测,G蛋白获得正确表达。将重组腺病毒接种小鼠,利用间接ELISA及病毒中和试验检测其体液免疫水平,结果显示可诱导产生VSV特异性抗体,其中和抗体水平在1∶32;利用淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平,结果表明可以引起接种小鼠强烈的淋巴细胞增殖。构建的重组腺病毒免疫小鼠后可以引起一定的体液免疫和细胞免疫反应,为表达VSV糖蛋白重组腺病毒疫苗的深入研究奠定了基础。

关键词： VSV G蛋白重组腺病毒免疫反应小鼠

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小反刍兽疫病毒H基因过表达对病毒增殖的影响

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中国兽医科学 2016年第11期46卷 1349-1357页

作者：赵玲娜金红岩薛晓娟隋修锟 zheney makay 梁琳李刚中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室/农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测试验站北京100193

为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T... 详细信息

为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P<0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。

关键词：小反刍兽疫病毒 H基因基因过表达病毒增殖

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抗小反刍兽疫病毒P蛋白单链抗体的制备及鉴定

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中国兽医科学 2016年第10期46卷 1226-1232页

作者：金红岩隋修锟刘欢李文超梁琳赵玲娜温施慧 zheney makay 李刚中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站西藏职业技术学院

为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总... 详细信息

为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,扩增VH基因和VL基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法获得单链抗体全长基因,并克隆至原核表达载体p ET32a(+)中,再将构建的重组质粒p ET32a-ScFv-3A6转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导单链抗体重组蛋白表达。结果,获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3A6、1P4、3F8和1P1,对m Ab 3A6进行了Western-blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。成功扩增了杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,获得了ScFv-3A6重组蛋白,大小为47 ku,证实该重组蛋白具有较强的抗原结合活性。上述研究结果表明,本研究获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并成功扩增到杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,实现了原核表达,为PPR防控新措施的研究奠定了基础。

关键词：小反刍兽疫病毒 P蛋白单链抗体原核表达

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DNA条形码技术在鸟类物种鉴定中的应用

DNA条形码技术在鸟类物种鉴定中的应用

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中国畜牧兽医学会信息技术分会第十届学术研讨会

作者： zheney makay 赵玲娜金红岩隋修馄梁琳薛晓娟李刚中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站

使用羽毛进行鸟类物种鉴定可以简化鸟类基因组DNA的样品处理,特别是当鸟的年龄或大小导致血液或组织样品DNA提取困难时。羽毛可以用来提取高质量的基因组DNA。首先,对羽毛羽根和近端部分进行裂解处理,再用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试... 详细信息

使用羽毛进行鸟类物种鉴定可以简化鸟类基因组DNA的样品处理,特别是当鸟的年龄或大小导致血液或组织样品DNA提取困难时。羽毛可以用来提取高质量的基因组DNA。首先,对羽毛羽根和近端部分进行裂解处理,再用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取基因组DNA。然后用特异性引物进行PCR扩增,得到线粒体细胞色素C氧化酶I序列片段,测序后通过BLAST鉴定鸟类物种。用这种方法对超过40个样本进行分析,鉴定出到6个鸟类物种。本实验方法也可应用于其他鸟类物种的鉴定,能广泛用于鸟类相关研究。

关键词：禽流感羽毛 DNA条形码技术野生鸟类品种鉴定细胞色素C氧化酶I

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