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A novel CRISPR/Cas9 system with high genomic editing efficiency and recyclable auxotrophic selective marker for multiple-step metabolic rewriting in Pichia pastoris

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Synthetic and Systems Biotechnology 2023年第3期8卷 445-451页

作者： Xiang Wang Yi Li zhehao jin Xiangjian Liu Xiang Gao Shuyuan Guo Tao Yu Center for Synthetic Biochemistry CAS Key Laboratory of Quantitative Engineering BiologyShenzhen Institute of Synthetic BiologyShenzhen Institutes of Advanced TechnologyChinese Academy of Sciences(CAS)Shenzhen518055China University of the Chinese Academy of Sciences Beijing100049China Center for Materials Synthetic Biology CAS Key Laboratory of Quantitative Engineering Biology of CASShenzhen Institute of Synthetic BiologyShenzhen Institutes of Advanced TechnologyChinese Academic of ScienceShenzhen518055China

The methylotrophic budding yeast Pichia pastoris has been utilized to the production of a variety of heterologous recombinant proteins owing to the strong inducible alcohol oxidase promoter(pAOX1).However,it is difficult to use P.pastoris as the chassis cell factory for high-valuable metabolite biosynthesis due to the low homologous recombination(HR)efficiency and the limitation of handy selective markers,especially in the condition of multistep biosynthetic pathways.Hence,we developed a novel CRISPR/Cas9 system with highly editing efficiencies and recyclable auxotrophic selective marker(HiEE-ReSM)to facilitate cell factory in P.pastoris.Firstly,we improved the HR rates of P.pastoris through knocking out the non-homologous-end-joining gene(Δku70)and overexpressing HR-related proteins(RAD52 and RAD59),resulting in higher positive rate compared to the basal strain,achieved 97%.Then,we used the uracil biosynthetic genes PpURA3 as the reverse screening marker,which can improve the recycling efficiency of marker.Meanwhile,the HR rate is still 100%in uracil auxotrophic yeast.Specially,we improved the growth rate of uracil auxotrophic yeast strains by overexpressing the uracil transporter(scFUR4)to increase the uptake of exogenous uracil from medium.Meanwhile,we explored the optimal concentration of uracil(90 mg/L)for strain growth.In the end,the HiEE-ReSM system has been applied for the inositol production(250 mg/L)derived from methanol in P.pastoris.The systems will contribute to P.pastoris as an attractive cell factory for the complex compound biosynthesis through multistep metabolic pathway engineering and will be a useful tool to improve one carbon(C1)bio-utilization.

关键词： Pichia pastoris Uracil auxotroph CRISPR/Cas9 Recyclable selective marker Homology directed repair

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金沙江干热河谷不同土地利用类型土壤水分变化特征及对降雨响应

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西部林业科学 2024年第2期53卷 9-16页

作者：何苗苗刘芝芹王克勤金奕彤金哲浩西南林业大学生态与环境学院云南昆明650224

为探究干热河谷地区土壤水分变化特征及其对降雨的响应,选取位于元谋干热河谷流域的草地、青枣林地、银合欢林地、坡耕地为研究对象,运用HOBOH21_USB土壤水分监测系统实时监测土壤含水量,同时使用TE525 mm翻斗式雨量筒测定2021年1—12... 详细信息

为探究干热河谷地区土壤水分变化特征及其对降雨的响应,选取位于元谋干热河谷流域的草地、青枣林地、银合欢林地、坡耕地为研究对象,运用HOBOH21_USB土壤水分监测系统实时监测土壤含水量,同时使用TE525 mm翻斗式雨量筒测定2021年1—12月的降雨量,以探明该流域土壤水分时间变化特征和垂直变化特征及各土层土壤含水量对不同级别降雨的响应。结果显示:(1)研究区4种土地利用类型土壤水分季节变化可划分为稳定期(1—5月)、快速增长期(6—7月)、稳升期(8—9月)和消耗期(10—12月)。(2)土壤水分含量垂直变化整体随土层深度增加而增加,小部分土层与总趋势有偏差。(3)在小雨(0.1~10 mm)情况下,4个样地均只有0~20 cm土层水分含量有微弱响应;在中雨(10.1~25 mm)条件下,降雨量对各样地的0~40 cm土层含水量产生补给作用;在大雨(25.1~50 mm)条件下,降雨量对各样地补给范围扩大到60 cm土层;在暴雨(>50 mm)情况下,各个样地各个土层均对降雨量有反应。结果表明:从土壤水分时空变化以及降雨响应整体来看,在该区域坡耕地比造林地更易储存土壤水分。研究结果可为气候炎热少雨,蒸发量远远大于降雨量的元谋干热河谷地区植被重建和生态恢复工作的开展提供参考。

关键词：干热河谷土壤水分时空变化金沙江

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基于白鲨算法的七自由度机械臂动力学参数辨识

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高技术通讯 2024年第5期34卷 505-514页

作者：倪洪杰张林峰金哲豪朱华中刘安东浙江工业大学信息工程学院杭州310023

本文提出了基于白鲨算法(WSO)的关节机器人动力学参数辨识方法。首先,利用SYMORO+软件建立了七自由度机械臂的动力学模型并将其转换为可辨识模型。其次,利用关节机器人的性质提取摩擦力矩进行摩擦模型辨识。然后,设计激励轨迹并让机器... 详细信息

本文提出了基于白鲨算法(WSO)的关节机器人动力学参数辨识方法。首先,利用SYMORO+软件建立了七自由度机械臂的动力学模型并将其转换为可辨识模型。其次,利用关节机器人的性质提取摩擦力矩进行摩擦模型辨识。然后,设计激励轨迹并让机器人跟踪该轨迹,用辨识摩擦模型计算关节力矩信号中的摩擦项并补偿。进而,采用最小二乘法(LS)估计器确定白鲨算法的搜索空间,并由白鲨算法迭代获得最优动力学参数。最后,在Franka协作臂进行了实验验证,结果表明所提方法相较于传统算法在规避局部最优解方面具有更好的表现,且得到的参数更准确。

关键词：动力学模型摩擦模型激励轨迹参数辨识白鲨算法(WSO)

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动物产科学人才培养质量提升策略与研究实践

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吉林农业科技学院学报 2022年第2期31卷 73-76页

作者：金哲浩周会敏邓佳玫吉林农业科技学院动物科技学院吉林132101

动物产科学是高等农业院校动物医学专业本科生的重要专业核心课程之一,系统阐述动物繁殖生理、繁殖技术和繁殖疾病三方面内容.随着国家畜牧业产业结构向集约化、规模化转变的不断深入,我国对动物医学专业的技术人员也相应提出了新的要求... 详细信息

动物产科学是高等农业院校动物医学专业本科生的重要专业核心课程之一,系统阐述动物繁殖生理、繁殖技术和繁殖疾病三方面内容.随着国家畜牧业产业结构向集约化、规模化转变的不断深入,我国对动物医学专业的技术人员也相应提出了新的要求.为了及时向社会输送高素质、综合型、实践型、创新型的动物医学专业技术人才,以注重学生综合能力培养为目标的动物产科学课程教学改革迫在眉睫.本文通过笔者多年的教学深入分析了吉林农业科技学院该课程教学存在的问题,并针对这些问题提出以提高教学效果、注重学生实践能力培养为目标的教学改革策略与方案,在教学实践中采取了一系列措施并在改善课堂秩序和提升本课程期末总评成绩方面获得了一些成效.

关键词：动物产科学人才培养质量提升策略实践

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Miller金字塔理论在麻醉学住院医师规范化培训中的应用

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中国继续医学教育 2022年第13期14卷 166-170页

作者：魏雨婷金哲浩林雪李文志哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科黑龙江哈尔滨150081

为了加强住院医师规范化培训力度,提高住院医师的临床胜任力,医学模拟教学应运而生。传统教学中单一技能的培训不能满足住院医师临床胜任力培养的需求,为了培养麻醉学住院医师的岗位胜任力,哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉模拟平台开发... 详细信息

为了加强住院医师规范化培训力度,提高住院医师的临床胜任力,医学模拟教学应运而生。传统教学中单一技能的培训不能满足住院医师临床胜任力培养的需求,为了培养麻醉学住院医师的岗位胜任力,哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉模拟平台开发了基于情景的规范化操作培训课程。该课程以Miller金字塔原理作为理论依据,将临床技能培训和情景模拟教学相结合,要求学员除掌握理论知识和操作技能外,还要重视在真实工作环境中的实际表现。单一的临床技能培训可以规范学员的操作习惯,情景模拟教学使学员身临其境,直观地感受和体会真正的临床工作情景,完整地体验临床工作流程,培训学员操作前评估和访视患者、识别和处理操作相关的并发症,帮助学员树立临床工作流程化、整体化的观念,避免重操作轻评估、重技术轻人文的临床思维和工作习惯,从而保障医疗安全。

关键词： Miller金字塔理论情景模拟教学法麻醉学住院医师规范化操作培训岗位胜任力医疗安全教育

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浅谈文明施工与施工企业的综合效益

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水利技术监督 2010年第3期18卷 52-53页

作者：金哲浩浙江泰阳建设有限公司浙江宁波315200

文明施工是指建设工程施工过程中按照规定采取措施,保障作业环境、现场环境卫生质量和人员健康安全的施工活动,即施工过程中的文明程度。文明施工使企业减少甚至不发生额外不该支出的费用,同时有利于社会的稳定,保障社会和谐发展。使施... 详细信息

文明施工是指建设工程施工过程中按照规定采取措施,保障作业环境、现场环境卫生质量和人员健康安全的施工活动,即施工过程中的文明程度。文明施工使企业减少甚至不发生额外不该支出的费用,同时有利于社会的稳定,保障社会和谐发展。使施工企业在获得经济效益的同时最大程度地获得社会效益。

关键词：水利工程施工企业施工现场文明施工综合效益

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长期进行10000m跑对男大学生骨骼代谢的影响

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沈阳体育学院学报 2011年第2期30卷 75-77页

作者：刘传勤董官清金哲浩中国地质大学体育部北京100083 北京科技大学体育部北京100083 韩国岭南大学

目的:探讨长期进行10 000m跑对我国男大学生骨骼代谢带来的影响。研究对象:男性大学生15人。方法:男性大学生长期进行10 000m跑(6个月,每周1次),监测并对比实验前后与骨骼代谢相关的生理生化指标变化。结果:在身体特征中,训练前后的体... 详细信息

目的:探讨长期进行10 000m跑对我国男大学生骨骼代谢带来的影响。研究对象:男性大学生15人。方法:男性大学生长期进行10 000m跑(6个月,每周1次),监测并对比实验前后与骨骼代谢相关的生理生化指标变化。结果:在身体特征中,训练前后的体重、体脂率、体脂量、腹部脂率、肌肉量上有着显著性差异;骨骼代谢标记变化中,降血钙素、甲状旁腺激素、碱性磷酸酶比训练前有细微的变化但没有显著性差异,而骨钙素显著性减少,脱氧吡啶啉显著性增加;磷在血液和尿液中显著性减少,但是钙没有减少,也没有显著性差异。结论:长期进行适宜运动强度的10 000m跑对我国男大学生骨骼代谢有着积极的锻炼意义。

关键词： 10000m跑男性大学生骨骼代谢骨骼代谢

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低温碱性蛋白酶芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学性质研究

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粮食科技与经济 2020年第1期45卷 76-79页

作者：石慧莫晨阳金喆昊武汉设计工程学院食品与生物科技学院湖北武汉430205

本研究从学院食堂附近的土样、人工湖水样和鲫鱼、鲶鱼的肠道中分离得到6株产蛋白酶菌株。经摇瓶发酵复筛后,选择产酶活高的菌株2、菌株5和菌株6进行形态学观察、生理生化鉴定和部分酶学性质研究。结果表明菌株2可能为短短芽孢杆菌,菌株... 详细信息

本研究从学院食堂附近的土样、人工湖水样和鲫鱼、鲶鱼的肠道中分离得到6株产蛋白酶菌株。经摇瓶发酵复筛后,选择产酶活高的菌株2、菌株5和菌株6进行形态学观察、生理生化鉴定和部分酶学性质研究。结果表明菌株2可能为短短芽孢杆菌,菌株5可能为苏云金芽孢杆菌,菌株6可能为地衣芽孢杆菌。研究3株菌所产蛋白酶的最适pH,发现2号、5号和6号菌株的最适pH分别为6.0、8.0和10.0。菌株5和菌株6所产蛋白酶在pH为8.0~10.0的缓冲液中处理30min后活性几乎不变,在碱性环境中均具有较好的稳定性。菌株5和菌株6所产蛋白酶的最适反应温度均为30℃,低于30℃处理30min活性几乎不变;50℃处理30min后,菌株5和菌株6的残余酶活分别20%和40%。

关键词：低温碱性蛋白酶芽孢杆菌筛选鉴定酶学性质

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新生血管性年龄相关性黄斑变性抗血管内皮细胞生长因子治疗的研究进展

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老年医学与保健 2021年第1期27卷 190-194页

作者：金哲豪沈念慈朱静吟复旦大学附属华东医院眼科上海200040

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是一种以中心视力丧失为主要症状的眼科疾病,主要累及视网膜的黄斑区[1-2]。AMD的患病率呈逐年递增趋势,已成为发达国家老年人视力下降的主要原因,影响着10%~13%的65岁以上老... 详细信息

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是一种以中心视力丧失为主要症状的眼科疾病,主要累及视网膜的黄斑区[1-2]。AMD的患病率呈逐年递增趋势,已成为发达国家老年人视力下降的主要原因,影响着10%~13%的65岁以上老人[3]。

关键词：血管内皮细胞生长因子眼科疾病 AMD 黄斑区视网膜

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蛋白激酶C在CO2预处理减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用

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中华麻醉学杂志 2014年第1期34卷 24-28页

作者：谭金锋段乐陶涛谭青云王现雷金哲浩崔晓光哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科黑龙江省麻醉与危重病学研究重点实验室黑龙江省普通高校麻醉基础理论与应用重点实验室 150086 佳木斯大学附属第一医院麻醉科

目的探讨蛋白激酶C（PKC）在CO2预处理减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用.方法成年健康雄性Wistar大鼠48只,8～ 10周龄,体重230 ～ 270 g,采用随机数字表法分为3组（n=16）：肝缺血再灌注损伤组（HIRI组）、CO2预处理组（P组）和PK... 详细信息

目的探讨蛋白激酶C（PKC）在CO2预处理减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用.方法成年健康雄性Wistar大鼠48只,8～ 10周龄,体重230 ～ 270 g,采用随机数字表法分为3组（n=16）：肝缺血再灌注损伤组（HIRI组）、CO2预处理组（P组）和PKC抑制剂白屈菜季铵碱组（CHE组）.采用夹闭肝左中叶的门静脉、肝动脉以及胆管1h随后再灌注4h的方法建立肝缺血再灌注损伤模型.机械通气时HIRI组吸入50％ O2-50％ N2,P组吸入50％O2-45％ N2-5％ CO21h,随后吸入50％O2-50％N2,15 min后制备模型；CHE组机械通气前10 min腹腔注射CHE 5 mg/kg,其余操作同P组.于机械通气前、缺血前即刻、再灌注即刻、1h、2h、3h和4h时记录MAP,取动脉血样,行血气分析.再灌注4h时,测定血清ALT和AST活性,采用ELISA法测定血清TNF-α浓度,取肝组织,测定MDA含量和SOD活性（分光光度法）、活化的caspase-3（免疫组化法）和PKC（Western blot法）的表达水平,计算凋亡指数（TUNEL法）.结果与HIRI组比较,P组缺血前即刻和再灌注期间MAP、PaO2和PaCO2升高,CHE组再灌注期间MAP和PaCO2升高,缺血前即刻和再灌注期间PaO2升高,P组和CHE组血清ALT和AST活性、TNF-α浓度、肝组织MDA含量降低,细胞凋亡指数降低,肝组织活化的caspase-3表达下调,P组SOD活性升高,PKC表达上调（P＜0.05或0.01）,CHE组SOD活性和PKC表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与P组比较,CHE组MAP再灌注即刻升高,再灌注1-4 h时降低,缺血前即刻和再灌注期间PaO2降低,再灌注3h时PaCO2降低,血清ALT和AST活性、TNF-α浓度、肝组织MDA含量和细胞凋亡指数升高,肝组织活化的caspase-3表达上调,PKC表达下调（P＜0.05）.结论 PKC参与了CO2预处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤的作用.

关键词：二氧化碳蛋白激酶C 再灌注损伤肝

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