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Development of PPA-EliSA for Detecting Antibodies against Porcine Pseudorabies Virus Using Truncated Recombinant Glycoprotein gD Expressed in ***

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Animal Husbandry and Feed Science 2011年第6期3卷 29-34页

作者： zu li-chuang SHEN Zhi-qiang li Jiao WANG Jin-liang Shandong Lvdu Biological Technology Co. Ltd. Binzhou 256600 China Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary MedicineAcademy Binzhou 256600 China

The purpose of this study was to develop a method for detecting antibodies against porcine pseudorabies virus （PRV）. According to the published genomic sequence of PRV SA strain, an approximately 1 070-bp gD gene fragment was amplified by PCR. The PCR products were cloned into the prokaryotic expression vector pET30a and the positive recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21. Through induction with IPTG, the recombinant gD protein was expressed as inclusion bodies. As analyzed by western blot assay, the purified recombinant gD protein had good antigenicity and high specificity. Using the purified gD protein as coating antigen and horseradish peroxidase labeled staphylococcal protein A （PPA） as secondary antibody, we developed a PPA-EliSA for detecting antibodies against porcine PPV. No cross-reaction with the positive sera against seven common pathogens in pigs including classical swine fever virus, porcine parvovirus, porcine reproductive and respiratory syndrome, Japanese encephalitis virus, porcine circovirus type 2, porcine epidemic diarrhea virus, transmissible gastroenteritis virus was observed. The repeatability test showed that the intra- and inter-assay coefficients of variation were lower than 5% and 10%, respectively. Compared with the EliSA gD antibody test kit produced by IDEXX, the coincidence, sensitivity and specificity of the developed PPA-EliSA were 92.0%, 95.1% and 88.1%, respectively. The developed PPA-EliSA had good repeatability, sensitivity and specificity and was a rapid and simple serological method for surveillance of PRV antibodies in pig herds as well as for rapid diagnosis and epidemiological investigation of PRV infection.

关键词： Porcine pseudorabies virus gD protein Truncated expression Enzyme linked immunosorbent assay

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Development of an Indirect EliSA Using Recombinant Truncated Envelope Glycoprotein for Detection of Antibodies against Japanese Encephalitis Virus

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Animal Husbandry and Feed Science 2010年第1期2卷 38-42页

作者： zu li-chuang WANG Jin-liang GUAN Yu SHEN Zhi-qiang DONG lin li Jiao Shandong Ludu Bio-Technology Co. Ltd. Binzhou 256600 China Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy Binzhou 256600 China

[ Objective] To develop an indirect EliSA assay for detecting antibodies against envelope glycoprotein （ E protein） of Japanese encephalitis virus （JEV）. [ Method] Specific primers were designed according to JEV sequences published in the GenBank. The cDNA of JEV E gene （about 1 000 10p） was amplified by the RT-PCR with the specific primers. After sequencing analysis, the E gene was cloned into pET30a expression vector and expressed in E. coli BL21 （DE3） with the induction of IPTG. After denaturation, purification and renaturation, the recombinant protein was analyzed by the SDS-PAGE and the westem blotting. An indirect EliSA was developed to detect antibodies against JEV. [ Result] The E protein was mainly expressed in inclusion body. With the purified E protein, the indirect EliSA was developed and displayed good specificity, sensitivity and repeatability, [ Conclusion]The developed EliSA using the truncated E protein as antigen is a simple, convenient and rapid serological method for diagnosis, monitoring antibody level and epidemiological investigation of JEV.

关键词： Japanese encephalitis virus E protein Prokaryotic expression Enzyme linked immunosorbent assay Antibodies

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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 200-205页

作者：李娇薛飞朱远茂祖立闯中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到... 详细信息

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)BA株接种MDBK细胞,提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列,利用Oligo 6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物,引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1 000 bp的E2基因片段,克隆到pMD18-T载体上,酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体,转化BL21表达菌。取转化菌培养,并用IPTG诱导,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,用免疫印迹与间接EliSA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性,为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白截短表达鉴定

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猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法研究进展

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动物医学进展 2012年第5期33卷 89-93页

作者：李娇沈志强祖立闯山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、... 详细信息

实时荧光定量PCR技术是结合PCR技术、光谱技术和计算机技术发展起来的一种新型分子生物学定量检测技术,其融合了PCR技术的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的特点,它不仅实现了对核酸模板的定量,而且具有特异性强、灵敏度高、重复性好、准确性高、自动化程度高、速度快、全封闭反应、无污染等优点,在猪瘟疫苗的定量检测、猪瘟的诊断以及猪瘟病毒强、弱毒株鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就荧光定量PCR技术及其在猪瘟诊断上的应用做一简要综述,为我国猪瘟的综合防控提供参考。

关键词：猪瘟实时荧光定量PCR 检测

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牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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中国兽医学报 2010年第12期30卷 1598-1601,1605页

作者：祖立闯王金良李娇魏凤沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因组序列,选择保守性比较高的5'非编码区,利用Oli-go6.0软件设计了2对特异性引物,建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法。结果表明,该方法重复性好、特异性强、敏感性高,可以准确快速检测出极低... 详细信息

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因组序列,选择保守性比较高的5'非编码区,利用Oli-go6.0软件设计了2对特异性引物,建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法。结果表明,该方法重复性好、特异性强、敏感性高,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,极大地提高了常规RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。临床初步应用表明,该方法可用于动物与疫苗生物制品原辅料BVDV的快速低含量检测。

关键词：牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR 检测

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植酸酶对鲤鱼生长及磷利用率的影响

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淡水渔业 2006年第5期36卷 20-23页

作者：杨雨虹郭庆祖立闯王枫东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030 中国农业科学院饲料研究所北京100081

选用300尾体重为50 g左右的鲤鱼鱼种,随机分为5组:对照组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组。对照组饲喂基础饲料,Ⅰ组饲喂每千克添加1500 U植酸酶的基础饲料,Ⅱ组饲喂每千克添加3000 U植酸酶的基础饲料,Ⅲ组饲喂每千克添加4.5 g Ca(H2PO4)2的... 详细信息

选用300尾体重为50 g左右的鲤鱼鱼种,随机分为5组:对照组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组。对照组饲喂基础饲料,Ⅰ组饲喂每千克添加1500 U植酸酶的基础饲料,Ⅱ组饲喂每千克添加3000 U植酸酶的基础饲料,Ⅲ组饲喂每千克添加4.5 g Ca(H2PO4)2的基础饲料,Ⅳ组饲喂每千克添加8.9 g Ca(H2PO4)2的基础饲料。结果显示:饲料中添加3000 U/kg和1500 U/kg植酸酶显著地促进了鲤鱼生长,降低了饲料系数,提高了饲料中磷的利用率。与对照组相比,3000 U/kg和1500 U/kg植酸酶组鲤鱼的增重率分别提高61.06%和52.81%,鲤鱼对饲料中磷的表观消化率分别提高65.63%和61.65%,粪磷含量分别下降24.58%和22.88%。本试验表明:植酸酶可以显著地促进鲤鱼的生长和提高磷的利用率。

关键词：鲤鱼植酸酶生长磷利用率

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核酸适体及其在疫病诊断中的应用

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动物医学进展 2011年第7期32卷 80-84页

作者：祖立闯王金良李娇沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

核酸适体是采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。因其具有亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等优点,逐渐成为抗体的代替或补充试剂,已成功应用于生物... 详细信息

核酸适体是采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。因其具有亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等优点,逐渐成为抗体的代替或补充试剂,已成功应用于生物芯片、生物传感器、分子信标等多种疫病诊断技术平台,显示出了良好的应用前景,在未来的疫病诊断中将发挥越来越重要的作用。论文就适体技术及其在疫病诊断中的应用进展进行综述。

关键词：核酸适体指数富集配体的系统进化技术疫病诊断

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胶体金免疫层析技术在动物疫病诊断上的应用

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动物医学进展 2010年第8期31卷 101-105页

作者：祖立闯王金良李娇沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

胶体金免疫层析技术是在胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术基础上发展起来的一种新型免疫学诊断技术。因其具有简便、快速、无污染、不需特殊仪器、特异性强、敏感性高、结果判断直观等优点,成为当前广泛采用的动物疫病免疫... 详细信息

胶体金免疫层析技术是在胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术基础上发展起来的一种新型免疫学诊断技术。因其具有简便、快速、无污染、不需特殊仪器、特异性强、敏感性高、结果判断直观等优点,成为当前广泛采用的动物疫病免疫学诊断技术。胶体金免疫层析技术在动物病毒病、细菌病、寄生虫病及水产动物疫病诊断方面都有非常广泛的应用,在未来的动物疫病诊断中将发挥越来越重要的作用。论文就胶体金免疫层析技术在动物疫病诊断上的应用进行综述。

关键词：胶体金免疫层析动物疫病诊断

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白的截短表达与间接EliSA诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2010年第3期32卷 200-204,231页

作者：祖立闯王金良管宇沈志强董林李娇山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

为建立一种快速检测流行性乙型脑炎病毒抗体的方法,本研究参照已发表的JEV基因组序列,应用RT-PCR扩增了长约1000bp的E基因片段,连接pET30a表达载体中,经诱导后获得了以包涵体形式表达的重组E蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明其... 详细信息

为建立一种快速检测流行性乙型脑炎病毒抗体的方法,本研究参照已发表的JEV基因组序列,应用RT-PCR扩增了长约1000bp的E基因片段,连接pET30a表达载体中,经诱导后获得了以包涵体形式表达的重组E蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明其具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测流行性乙型脑炎病毒抗体的E-EliSA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为JEV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和JEV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

关键词：乙型脑炎病毒 E蛋白截短表达间接EliSA

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鸭源禽腺病毒分离株的致病性及细胞培养特性研究

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中国兽医学报 2019年第3期39卷 397-400,413页

作者：苗立中魏凤毕研丽祖立闯王艳沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600

为进一步了解Ⅰ群禽腺病毒鸭源分离株的致病性和生物学特性,采取接种鸡胚和鸭胚,攻毒SPF鸡和雏鸭,并应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝细胞(CEL)培养观察细胞病变。试验结果表明,SPF鸡胚和鸭胚均出现死亡以及心包积液等典型症状,SPF鸡和... 详细信息

为进一步了解Ⅰ群禽腺病毒鸭源分离株的致病性和生物学特性,采取接种鸡胚和鸭胚,攻毒SPF鸡和雏鸭,并应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝细胞(CEL)培养观察细胞病变。试验结果表明,SPF鸡胚和鸭胚均出现死亡以及心包积液等典型症状,SPF鸡和雏鸭也引起不同程度死亡,且出现与临床送检病例类似的症状,PCR检测与序列分析证实分离的2株鸭源Ⅰ群禽腺病毒均为FadV-4血清型,病毒接种CEF细胞后没有细胞病变,而接种CEL细胞后则出现很强的聚集性、细胞变圆等典型病变。表明分离的鸭源FadV-4对SPF鸡和雏鸭均具有一定的致病性,对CEL细胞具有一定的适应性。

关键词：鸭 Ⅰ群禽腺病毒致病性细胞培养特性

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