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Generation of a Triple-Shuttling Vector and the Application in Plant Plus-Strand RNA Virus Infectious cDNA Clone Construction

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The dynamics of N6-methyladenine RNA modification in interactions between rice and plant viruses

中国植物病理学会2023年学术年会

作者： FENG Chenwei GUO Xiao GU Tianxiao HUA Yanhong zhuang xinjian ZHANG Kun Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics Jiangsu Engineering and Technology Research Center for MicrobiologyCollege of Life SciencesNanjing Normal University

Infectious cloning of plant viruses is a powerful tool for studying the reverse genetic manipulation of viral genes in virus-host plant interactions, contributing to a deeper understanding of the life history and pathogenesis of viruses.Yet, most of the infectious clones of RNA virus constructed inE.coli are unstable and toxic.Therefore, we modified the binary vector pCass4-Rz and constructed the ternary shuttle vector pCA4 Y.The pCA4 Y vector has a higher copy number in the E.coli than the conventional pCB301 vector, can obtain a high concentration of plasmid, and is economical and practical, so it is suitable for the construction of plant virus infectious clones in basic laboratories.The constructed vector can be directly extracted from yeast and transformed into Agrobacterium tumefaciens to avoid toxicity in E.coli.Taking advantage of the pCA4 Y vector, we established a detailed large and multiple DNA HRbased cloning method in yeast using endogenous recombinase.We successfully constructed the Agrobacterium-based infectious cDNA clone of ReMV.This study provides a new choice for the construction of infectious viral clones.

关键词：

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The dynamics of N6-methyladenine RNA modification in interac...

中国植物病理学会2021年学术年会

作者： ZHANG Kun zhuang xinjian DONG Zhuozhuo XU Kai CHEN Xijun LIU Fang HE Zhen Department of Plant Protection College of Horticulture and Plant protectionYangzhou University Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics Jiangsu Engineering and Technology Research Center for MicrobiologyCollege of Life SciencesNanjing Normal University

N-methyladenosine(m6 A) is the most common mRNA modification in eukaryotes and has been implicated as a novel epigenetic marker that is involved in various biological processes.The pattern and functional dissection of m6 A in the regulation of several major human viral diseases have already been reported.However,the patterns and functions of m6 A distribution in plant disease bursting remain largely unknown.We analyse the high-quality m6 A methylomes in rice plants infected with two devastating viruses.We find that the m6 A methylation is mainly associated with genes that are not actively expressed in virus-infected rice plants.We also detect different m6 A peak distributions on the same gene,which may contribute to different antiviral modes between rice stripe virus or rice black-stripe dwarf virus infection.Interestingly,we observe increased levels of m6 A methylation in rice plant response to virus infection.Several antiviral pathway-related genes,such as RNA silencing-,resistance-,and fundamental antiviral phytohormone metabolic-related genes,are also m6 A methylated.The level of m6 A methylation is tightly associated with its relative expression levels.We reveal the dynamics of m6 A modification during the interaction between rice and viruses,which may act as a main regulatory strategy in gene expression.Our investigations highlight the significant of m6 A modifications in interactions between plant and viruses,especially in regulating the expression of genes involved in key pathways.

关键词： rice and plant viruses N~6-methyladenine RNA modification

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梧州市毒蛇咬伤流行病学调查研究

蛇志 2024年第1期36卷 27-29,91页

作者：严欣健黄运妮李聪曾昭谭琳黄水伟梧州市中医医院急诊科广西梧州543002 梧州市中西医结合医院急诊科广西梧州543002

目的调查梧州市辖区毒蛇咬伤的流行病学特征,为蛇伤防治提供依据。方法采用回顾分析方法,选取2014年1月至2018年12月梧州市中医医院和梧州市中西医结合医院收治的917例毒蛇咬伤患者作为研究对象,收集并统计致伤毒蛇种类、患者职业、致... 详细信息

目的调查梧州市辖区毒蛇咬伤的流行病学特征,为蛇伤防治提供依据。方法采用回顾分析方法,选取2014年1月至2018年12月梧州市中医医院和梧州市中西医结合医院收治的917例毒蛇咬伤患者作为研究对象,收集并统计致伤毒蛇种类、患者职业、致伤月份及地域、严重程度、疗效评定等资料,分析梧州市辖区毒蛇咬伤患者的流行病学特点。结果917例毒蛇咬伤患者中,致伤毒蛇种类以烙铁头蛇(30.86%)、竹叶青蛇(26.28%)和眼镜蛇咬伤(22.90%)为主。地域分布显示,梧州市与辖区的藤县、苍梧县、岑溪市的蛇伤病例相近。咬伤月份集中在夏、秋两季,其中以7~10月为高发月份,占59.54%。职业分布以农民最多,占71.43%。蛇伤严重度评分以轻度(72.08%)和中度(26.17%)为主,其中轻度的疗效评定以治愈(72.01%)为主,中度的疗效评定以好转(65.42%)为主,重度的疗效评定以好转(75.0%)为主。结论梧州市辖区主要致伤毒蛇种类为烙铁头蛇、竹叶青蛇和眼镜蛇,以夏秋两季发病高,受伤群体以农民为主,蛇伤患者的地域分布无明显差异,毒蛇咬伤整体严重程度以轻度、中度为主,疗效评定预后较好。

关键词：梧州地区毒蛇咬伤流行病学

河南温县地黄上瓜类褪绿黄化病毒的鉴定及其CP序列分析

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植物病理学报 2022年第2期52卷 296-300页

作者：庄新建郭枭丁诗文董卓倬贺振张坤扬州大学园艺与植物保护学院扬州225000

0引言地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科(Scrophulariaceae)多年生草本植物,根部为传统中药材,主要产区分布在山东、山西、河南、河北、北京等地。地黄栽培中通常使用块根进行无性繁殖,易导致病毒病积累发生,从而严重影响地... 详细信息

0引言地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科(Scrophulariaceae)多年生草本植物,根部为传统中药材,主要产区分布在山东、山西、河南、河北、北京等地。地黄栽培中通常使用块根进行无性繁殖,易导致病毒病积累发生,从而严重影响地黄的产量与质量[1]。目前侵染地黄的植物病毒主要有烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)、地黄花叶病毒(rehmannia mosaic virus,ReMV)、油菜花叶病毒(youcai mosaic virus,YoMV)、蚕豆萎蔫病毒2号(broad bean wilt virus 2,BBWV2)、车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus,P1AMV)等[2]。

关键词：烟草花叶病毒油菜花叶病毒植物病毒多年生草本植物产区分布地黄无性繁殖传统中药材

地黄花叶病毒河南分离物检测鉴定及其MP序列分析

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2022年第3期43卷 102-107页

作者：郭枭冯陈尉庄新建丁诗文董卓倬贺振张坤扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225009

2019年夏,在河南温县中草药园内发现种植的地黄呈现疑似病毒侵染所表现出的褪绿、花叶等症状,采集该样品,用Trizol法提取地黄样品总RNA,分离其siRNA,并进行文库构建和siRNA高通量测序。将测序结果经接头去除、拼接组装后(Velvet Softwar... 详细信息

2019年夏,在河南温县中草药园内发现种植的地黄呈现疑似病毒侵染所表现出的褪绿、花叶等症状,采集该样品,用Trizol法提取地黄样品总RNA,分离其siRNA,并进行文库构建和siRNA高通量测序。将测序结果经接头去除、拼接组装后(Velvet Software 0.7.31,k=17),与NCBI数据库中序列进行核酸比对分析,发现该样品中存在着地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)和瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)的部分片段。通过RT-PCR确认该样品存在ReMV的侵染,使用商业化的ELISA试剂盒进一步确认该样品被ReMV侵染过。进一步克隆ReMV河南分离物的MP序列,并结合NCBI数据库中发布的该病毒MP序列,构建了基于MP序列的ReMV河南分离物系统发育树。该研究丰富了ReMV群体的传播范围及其基因组遗传信息,为后续ReMV的深入研究奠定了基础。

关键词：地黄地黄花叶病毒检测方法基因克隆序列分析

Ultrafast Excited State Dynamics of Biliverdin Dimethyl Ester Coordinate with Zinc Ions

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Chinese Journal of Chemical Physics 2020年第1期33卷 69-74,I0030-I0033页

作者： zhuang Chen Yang-yi Liu Xiao-xiao He Jin-quan Chen State Key Laboratory of Precision Spectroscopy East China Normal UniversityShanghai 200241China Collaborative Innovation Center of Extreme Optics Shanxi UniversityTaiyuan 030006China

As one of the biological endogenous pigments,biliverdin(BV)and its dimethyl ester(BVE)have extremely weak uorescence in solution with quantum yield less than 0.01%.However,the situation reverses with the addition of zinc ions.The strength for uorescence of BVE-Zn^2+ complex is greatly enhanced and uorescence quantum yield can increase to5%.Herein,we studied ultrafast excited state dynamics of BVE-Zn^2+ complex in ethanol,npropanol,and DMSO solutions in order to reveal the mechanism of uorescence quantum yield enhancement.The results show that BVE can form a stable coordination complex with zinc with 1:1 stoichiometry in solution.BVE is structurally and energetically more stable in the complex.Using picosecond time-resolve uorescence and femtosecond transient absorption spectroscopy,we show that smaller non-radiative rate constant of BVE-Zn^2+ complex in DMSO is the key to increasing its uorescence quantum yield and the excited state decay mechanism is also revealed.These results provide valuable information about the uorescence property change after BVE binding to metal ions and may provide a guidance for the study of phytochromes or other uorescence proteins in which BV/BVE acts as chromophores.

关键词： Biliverdin Zinc Fluorescence Quantum yield Femtosecond transient absorption Excited state dynamics

地黄花叶病毒河南分离物的CP基因克隆及序列分析

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2023年第4期44卷 113-118页

作者：冯陈尉李正刚郭枭庄新建丁诗文董卓倬贺振王铁霖张坤扬州大学植物保护学院江苏扬州225009 广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640 中国中医科学院中药资源中心北京100700

为探究地黄花叶病毒(rehmannia mosaic virus,ReMV)在河南地黄上的发生与分布及其基因变异情况,从河南温县中草药园采集若干疑似受病毒侵染而呈现出花叶、枯萎等症状的地黄样品,用酚仿法提取地黄样品总RNA,通过PCR扩增目的基因地黄花叶... 详细信息

为探究地黄花叶病毒(rehmannia mosaic virus,ReMV)在河南地黄上的发生与分布及其基因变异情况,从河南温县中草药园采集若干疑似受病毒侵染而呈现出花叶、枯萎等症状的地黄样品,用酚仿法提取地黄样品总RNA,通过PCR扩增目的基因地黄花叶病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因片段,经过回收纯化后,克隆至pMD19-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,随机挑选4个阳性单克隆测序,最后将结果与NCBI数据库中已有的核苷酸序列进行比对,并结合NCBI数据库中已发布的不同地区ReMV分离物的CP基因序列,构建基于CP^(ReMV)核苷酸序列的ReMV不同地区分离物的系统进化树。结果表明:成功克隆出ReMV河南分离物的CP基因,将该序列上传至NCBI后获得GenBank登录号为OM964874;通过构建系统发育进化树,该分离物与郑州、山西、韩国报道的ReMV分离物亲缘关系较近,可能有相近传染源,而与美国、日本的分离物亲缘关系较远,存在一定的遗传分化,序列一致性分析结果与此一致。综上,这一研究扩大了ReMV群体的传播范围,丰富了其基因信息,为揭示ReMV的致病机制奠定了基础。

关键词：地黄花叶病毒外壳蛋白基因克隆进化树分析

本氏烟转录因子bZIP60多克隆抗血清的制备及其应用

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中国烟草学报 2021年第4期27卷 122-126页

作者：张浩庄新建郭枭徐红梅贺振张坤扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225000

【背景和目的】植物未折叠蛋白应答(Unfolded protein response,UPR)信号通路在植物生长发育调控、逆境胁迫应答、内质网压力缓解等过程中起到重要作用,其中的bZIP60蛋白在该通路中起到关键核心作用。为了检测本氏烟UPR机制中bZIP60蛋... 详细信息

【背景和目的】植物未折叠蛋白应答(Unfolded protein response,UPR)信号通路在植物生长发育调控、逆境胁迫应答、内质网压力缓解等过程中起到重要作用,其中的bZIP60蛋白在该通路中起到关键核心作用。为了检测本氏烟UPR机制中bZIP60蛋白的表达,制备其抗血清用以探究其生物学功能。【方法】通过RT-PCR方法从本氏烟中克隆了bZIP60基因,然后将该基因连接至原核表达载体pET28a上,导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经1 mM IPTG诱导表达分子量约35 kDa的融合蛋白,用Ni-NTA亲和柱纯化获得靶标蛋白。最后以纯化的bZIP60蛋白辅以佐剂皮下免疫新西兰大白兔制备抗血清。【结果】Western blot分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测到由喷施DTT引起本氏烟中bZIP60蛋白的表达。【结论】本研究通过原核表达技术成功获得融合His标签的bZIP60重组蛋白并制备了相应的抗血清,为下一步深入探究病原物与植物互作中bZIP60的分子机理提供研究基础。

关键词： bZIP60蛋白原核表达抗血清制备 Western blot检测

"二段法"肺动脉重建矫治婴幼儿右肺动脉缺如

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中华胸心血管外科杂志 2021年第1期37卷 1-4页

作者：闫新建庄建陈寄梅岑坚正温树生许刚广东省心血管病研究所广东省人民医院广东省华南结构性心脏病重点实验室先心病外科病区广州510080

目的:总结婴幼儿右侧肺动脉缺如(ARPA)的外科诊疗经验,提高婴幼儿ARPA临床疗效。方法:2019年2月至4月,3例右侧肺动脉缺如患儿接受外科诊疗,均为男性,手术时间分别为出生后33天、85天和20个月,3例均行心脏增强CT扫描,其中1例行肺静脉逆... 详细信息

目的:总结婴幼儿右侧肺动脉缺如(ARPA)的外科诊疗经验,提高婴幼儿ARPA临床疗效。方法:2019年2月至4月,3例右侧肺动脉缺如患儿接受外科诊疗,均为男性,手术时间分别为出生后33天、85天和20个月,3例均行心脏增强CT扫描,其中1例行肺静脉逆行楔形造影。明确诊断及术前评估。3例患儿均于非体外循环下,探查解剖出闭锁动脉导管,继而采用"二段法"重建右肺动脉(RPA)。术后随访其肺动脉血流、肺动脉高压进展及抗凝治疗。结果:3例患儿心脏CT三维重建均于无名动脉根部见异常"憩室"或"芽迹",术中探查其为闭锁动脉导管的一端,另一端则连接肺门血管;肺静脉逆行楔形造影可明确显示患侧肺血管分布及发育。重建RPA后肺动脉高压即刻缓解。术后3例患儿均痊愈出院(100%),早期复查1例出现右肺动脉血栓,予以肝素持续抗凝后血栓消失,2例右肺动脉血流持续通畅。3例患儿目前服用华法林或阿司匹林规律抗凝。结论:ARPA可诊断、可治疗。婴幼儿期行"二段法"肺动脉重建效果良好。术前CT三维重建见异常"憩室"或"芽迹"具有重要提示意义,目前肺静脉逆行楔形造影为诊断金标准。

关键词：右侧肺动脉缺如婴幼儿外科治疗