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中国海南野番茄上的一种新病毒-野番茄花叶病毒

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生物技术 2015年第4期25卷 359-363页

作者：张真章绍延余乃通王健华龚殿刘志昕海南大学农学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101

[目的]鉴定引起海南水茄叶片呈典型皱缩和轻微花叶症状的病原物。[方法]对该病样提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后设计WTMV(Wild tomato mosaic virus)cp基因的特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为WTMV。[结果]通过PCR扩增... 详细信息

[目的]鉴定引起海南水茄叶片呈典型皱缩和轻微花叶症状的病原物。[方法]对该病样提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后设计WTMV(Wild tomato mosaic virus)cp基因的特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为WTMV。[结果]通过PCR扩增获得一段约900 bp的DNA序列,包含WTMV全部CP(813 bp)蛋白基因编码区。分析表明该片段编码270个氨基酸,与WTMV-Laichua分离物核酸序列同源性为89%,氨基酸序列同源性为94%,且在所有的WTMV分离物中保守,可形成一个小的group。与其它马铃薯Y病毒属病毒的同源关系依次是PVMV、Chi VMV-Ⅰ、其它16个potyviruses(包括8个属于Chi VMV-Ⅱ的Chi VMV)。[结论]确定了引起海南水茄叶片皱缩和轻微花叶症状的病原物为野番茄花叶病毒(WTMV)。海南WTMV该分离物CP蛋白基因的Gen Bank登录号为KR781519。据我们所知,这是国内首次发现WTMV自然侵染水茄。

关键词：反转录 PCR 水茄番茄花叶病毒

本生烟eIF4Es基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建

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基因组学与应用生物学 2019年第12期38卷 5550-5557页

作者：张春微张秀春陈柏岑武亚丹余乃通王健华刘志昕海南大学热带农林学院海口5702281 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101

由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病,是危害木薯的主要病害之一。目前尚无有效防治方法,并且特别是缺乏CBSV/UCBSV抗性育... 详细信息

由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病,是危害木薯的主要病害之一。目前尚无有效防治方法,并且特别是缺乏CBSV/UCBSV抗性育种材料。真核翻译起始因子4E(eukaryotie translation initiation factor4E,eIF4E)不仅参与蛋白质的翻译起始,并且Potyviruses的复制和翻译也依赖于eIF4E与病毒基因组连接蛋白(virus genome linked protein,VPg)的相互作用,目前发现的植物隐性抗病基因大部分都是eIF4E家族的等位基因。本研究利用生物信息学方法和RT-PCR技术获得本生烟(Nicotiana benthamiana)eIF4E家族的8个基因,聚类分析显示它们分别编码eIF4E、eIF4E的异构体和类似帽结合的蛋白。为筛选与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E家族蛋白,本研究进一步构建了这8个基因的Lex A-酵母双杂交系统的诱饵载体,并导入酵母细胞EGY48(p8op-LacZ)进行细胞毒性和自激活检测。结果显示导入重组质粒的EGY48(p8op-LacZ)酵母细胞在SD/-His/-Ura缺陷型培养基上生长良好,在SD/-Trp/-Ura缺陷型平板上不生长,并且在SD/Gal/Raf/-His/-Ura/X-Gal培养基上不显蓝色,说明重组质粒表达产物不仅对该酵母细胞无毒性,而且对下游报告基因无自激活作用,可用于该系统的互作蛋白筛选研究。本研究为利用酵母双杂交系统发现与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E基因,探索通过基因编辑与CBSV/UCBSV互作的寄主因子进行抗CBSV/UCBSV分子育种提供科学依据。

关键词：本生烟 eIF4E家族酵母双杂交载体构建自激活

甜椒脉斑驳病毒(PVMV)在海南的发现与检测

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热带作物学报 2015年第5期36卷 966-971页

作者：梁洁王健华章绍延余乃通张雨良王祥刘志昕海南大学环境与植物保护学院海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101 海南大学农学院海南海口570228

2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到p MD18-T载... 详细信息

2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到p MD18-T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明:该条带序列(包含部分NIb和部分cp基因)与已收录的甜椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(Gen Bank登录号:FM202327)序列相似性最高,达99%。设计cp基因的特异引物,对上述样品进行cp基因扩增并构建以cp基因序列为基础的系统进化树,发现海南辣椒上的PVMV与台湾的PVMV分离物ns1株同源性最高。田间检测结果表明:海南黄灯笼辣椒上PVMV的检出率高达74.07%,说明PVMV可能成为海南辣椒生产上的潜在威胁。

关键词：辣椒病毒病 PVMV 系统进化树分析

本生烟瞬时表达系统快速检测RNAi载体沉默效果

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分子植物育种 2017年第12期15卷 4933-4939页

作者：武亚丹张秀春冼淑丽余乃通王健华刘志昕海南大学热带农林学院海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101

RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为快速检测RNAi载体的沉默效果,通过构建木薯eIF4E3基因的过量表达载体pAI-Ca4E3以及靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3,利用农杆菌注射法将表达载体在本生烟叶片中进行瞬... 详细信息

RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为快速检测RNAi载体的沉默效果,通过构建木薯eIF4E3基因的过量表达载体pAI-Ca4E3以及靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3,利用农杆菌注射法将表达载体在本生烟叶片中进行瞬时表达。半定量RT-PCR检测结果显示单独注射过量表达载体pAI-Ca4E3或与表达载体pCAMBIA1300共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、第5天和第6天都能检测到木薯eIF4E3基因的高效表达,并且二者木薯eIF4E3基因表达量基本相同,说明木薯eIF4E3基因能在本生烟中高效瞬时表达,但是过量表达载体pAI-Ca4E3与干扰载体p1300-Ca4E3共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、第5天还是第6天后都几乎检测不到木薯eIF4E3基因的表达,说明过量表达载体表达的木薯eIF4E3基因已被干扰载体有效沉默。研究结果表明,已建立同时表达靶标基因和干扰靶标基因的干扰载体的本生烟瞬时表达系统,并结合半定量RT-PCR进行RNAi载体沉默效果检测的方法。该方法在农杆菌注射4 d后就能有效的检测RNAi载体的沉默效果,具有快捷、操作简便等特点,为RNAi技术应用于基因功能研究提供简单、快捷、有效的证据。

关键词：本生烟瞬时表达干扰载体半定量RT-PCR 沉默效果检测

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

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热带作物学报 2012年第12期33卷 2252-2256页

作者：张雨良黄启星张树珍王健华余乃通刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段。将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKT7-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组... 详细信息

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段。将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKT7-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用。研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础。

关键词：高粱花叶病毒 Hcpro CP PIPO 酵母双杂交诱饵载体

坡柳(Dodonaea viscosa L.)丛枝植原体新病原的分子鉴定

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基因组学与应用生物学 2018年第6期37卷 2423-2429页

作者：笈小龙吴育鹏谢慧敏余乃通王健华张秀春刘志昕海南大学热带农林学院海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所、农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101 文昌市农产品质量安全检验检测站文昌571300

从四川攀枝花芒果园中表现为丛枝、小叶和黄花等症状的坡柳植株发病样品中,利用植原体16S rDNA基因的通用引物R16m F2/R16m R1和R16F2n/R16R2,对发病植株总DNA进行巢式PCR检测,同时设计植原体抗原膜蛋白基因（AntMP）的保守引物AntMP-F/... 详细信息

从四川攀枝花芒果园中表现为丛枝、小叶和黄花等症状的坡柳植株发病样品中,利用植原体16S rDNA基因的通用引物R16m F2/R16m R1和R16F2n/R16R2,对发病植株总DNA进行巢式PCR检测,同时设计植原体抗原膜蛋白基因（AntMP）的保守引物AntMP-F/AntMP-R进行PCR验证。结果显示,坡柳样品巢式PCR的第一轮、第二轮DNA条带大小分别为1 400 bp和1 200 bp左右,经NCBI序列相似性比较均为植原体16S rDNA序列,Gen Bank登录号为KT957205和KT957206;PCR结果显示抗原膜蛋白基因大小约600 bp,与目标基因大小一致。将测得的16S rDNA基因序列与Gen Bank数据库中登录的16SrⅠ～ⅩⅤ组植原体16S rDNA序列进行同源性比对,构建系统进化树,结果显示四川坡柳丛枝植原体（DOVI-SC）属于16SrⅠ组（即翠菊黄花组）,与已报道的5个16SrⅠ组（AY101386,AY566302,AY389822,L33760和KP662119）同属一个组。利用植原体亚组分类鉴定软件iPhy Classfier对获得的2条植原体16S rDNA序列进行虚拟RFLP分析,结果显示KT957205,KT957206与16SrⅠ-B亚组洋葱黄化植原体（NC-005303）相似度分为1.0、0.97,归属于16SrⅠ-B亚组。本研究对引起四川坡柳丛枝的植原体病原进行检测,为坡柳植原体病害的早期诊断、快速检测以及预防措施制定提供科学线索。

关键词：坡柳植原体分子鉴定系统进化树

木薯eIF4E7基因RNAi载体构建及沉默效果分析

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热带作物学报 2017年第11期38卷 2082-2088页

作者：张秀春武亚丹张春微王健华余乃通刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101 海南大学热带农林学院海南海口570228

由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病(CBSD)严重威胁着非洲木薯种植业的发展,且目前没有十分有效的防治方法。病毒侵染植... 详细信息

由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病(CBSD)严重威胁着非洲木薯种植业的发展,且目前没有十分有效的防治方法。病毒侵染植物需要借助植物的翻译和复制系统来完成基因组的翻译及自身的复制,其中真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,e IF4E)是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。e IF4E7是木薯编码的e IF4E基因家族成员之一,本研究构建该靶标基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E7。本生烟瞬时表达系统结合半定量RT-PCR的方法证明,该载体能高效沉默过量表达载体p AI-Ca4E7中的e IF4E7基因在本生烟叶片中的表达。研究结果为进一步研究木薯e IF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及利用RNA技术干扰植物基因的病毒防治新策略奠定基础。

关键词：木薯 e IF4E7 干扰载体本生烟瞬时表达半定量RT-PCR 沉默效果

甘蔗黄叶病毒P0蛋白基因细菌双杂交诱饵载体的构建和自激活鉴定

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基因组学与应用生物学 2015年第4期34卷 836-841页

作者：杨文君余乃通张雨良王健华谢慧敏刘锋刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101 雅安职业技术学院雅安625000

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank ***342888),设计P... 详细信息

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank ***342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。

关键词：甘蔗黄叶病毒 P0蛋白基因细菌双杂交诱饵质粒构建

香蕉分化芽BBTVDAS-ELISA检测方法的建立和应用

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植物保护 2014年第5期40卷 117-120页

作者：周朋余乃通章绍延王健华胡加谊王祥梁洁刘志昕中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海口571101 海南大学农学院海口570228

为了解海南海口香蕉分化芽携带香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的情况,本研究建立了双抗夹心酶联免疫反应(DAS-ELISA)检测法,对来自海南地区组培厂的香蕉分化芽进行检测。检测结果表明,6个品种1 852个香蕉分化芽平均带毒率... 详细信息

为了解海南海口香蕉分化芽携带香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的情况,本研究建立了双抗夹心酶联免疫反应(DAS-ELISA)检测法,对来自海南地区组培厂的香蕉分化芽进行检测。检测结果表明,6个品种1 852个香蕉分化芽平均带毒率为2.1%,其中‘皇帝蕉’为1.98%,‘粤科1号’为2.07%,‘广粉蕉’为1.98%,‘大蕉’为6.25%,‘218’为1.89%,‘巴西蕉’为2.25%。为了进一步验证ELISA结果的可靠性,随机选取12个阳性样品提取总DNA进行PCR鉴定。鉴定结果显示,12个样品中11个检测出有BBTV,表明DAS-ELISA方法的准确率较高,与分子检测结果基本一致,可以胜任日常香蕉组培苗BBTV的检测。

关键词：香蕉束顶病毒 DAS-ELISA 病毒检测