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Facilitating stable gene integration expression and copy number amplification in Bacillus subtilis through a reversible homologous recombination switch

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Synthetic and Systems Biotechnology 2024年第3期9卷 577-585页

作者： Haoyu Guo Rongzhen Tian yaokang wu Xueqin Lv Jianghua Li Long Liu a b Guocheng Du Jian Chen Yanfeng Liu Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology Ministry of EducationSchool of BiotechnologyJiangnan UniversityWuxi214122China Science Center for Future Foods Jiangnan UniversityWuxi214122China Engineering Research Center of Ministry of Education on Food Synthetic Biotechnology Jiangnan UniversityWuxi214122China Jiangsu Province Engineering Research Center of Food Synthetic Biotechnology Jiangnan UniversityWuxi214122China

Strengthening the expression level of integrated genes on the genome is crucial for consistently expressing key enzymes in microbial cell factories for efficient bioproduction in synthetic *** comparison to plasmid-based multi-copy expression,the utilization of chromosomal multi-copy genes offers increased stability of expression level,diminishes the metabolic burden on host cells,and enhances overall genetic *** this study,we developed the“BacAmp”,a stabilized gene integration expression and copy number amplification system for high-level expression in Bacillus subtilis,which was achieved by employing a combination of repressor and non-natural amino acids(ncAA)-dependent expression system to create a reversible switch to control the key gene recA for homologous *** the reversible switch is turned on,genome editing and gene amplification can be ***,the reversible switch was turned off therefore stabilizing the gene copy *** stabilized gene amplification system marked by green fluorescent protein,achieved a 3-fold increase in gene expression by gene amplification and maintained the average gene copy number at 10 after 110 *** we implemented the gene amplification system for the regulation of N-acetylneuraminic acid(NeuAc)synthesis,the copy number of the critical gene increased to an average of 7.7,which yielded a 1.3-fold NeuAc *** research provides a new avenue for gene expression in synthetic biology and can be applied in metabolic engineering in ***.

关键词： Bacillus subtilis Stabilized gene amplification system Homologous recombination recA

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枯草芽孢杆菌中人乳铁蛋白的表达与分泌

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1895-1908页

作者：张予婷李洋武耀康刘延峰李江华堵国成吕雪芹刘龙江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学未来食品科学中心江苏无锡214122

人源乳铁蛋白(human lactoferrin,HLF)是母乳中重要的营养成分,具有抗菌、消炎、提高机体免疫力等功能。本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G601为宿主,对比了3种组成型(P_(21)、P_(43)和P_(veg))和3种诱导型启动子(P_(grac100)、... 详细信息

人源乳铁蛋白(human lactoferrin,HLF)是母乳中重要的营养成分,具有抗菌、消炎、提高机体免疫力等功能。本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G601为宿主,对比了3种组成型(P_(21)、P_(43)和P_(veg))和3种诱导型启动子(P_(grac100)、P_(xylA)和P_(tet*))对HLF表达的影响,摇瓶发酵结果显示,启动子P_(tet*)驱动的HLF的表达量最高,为651.57μg/L;进一步对核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)和信号肽进行组合筛选,获得的RBS-信号肽组合RBS6-SP_(yycP)促使HLF的总表达量提升至1099.87μg/L,其中分泌至胞外的蛋白量为498.68μg/L;为了提高蛋白的胞外分泌量,敲除细胞壁表面离子相关基因dlt D,菌株HLF分泌产量达到637.28μg/L。本研究通过表达元件筛选与优化等策略成功实现了HLF在***的分泌表达,为构建***细胞工厂高效合成乳蛋白奠定了基础。

关键词：乳铁蛋白枯草芽孢杆菌核糖体结合位点(RBS)-信号肽筛选分泌表达

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动态调控元件及其在微生物代谢工程中的应用

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化工学报 2018年第1期69卷 272-281页

作者：武耀康刘延峰李江华堵国成刘龙陈坚江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

代谢工程是通过对代谢途径的设计、构建与优化,进行营养品、药品、生物燃料以及化工产品等各种生物基产品合成的关键技术。传统的改造策略如基因的敲除、弱化与过表达会造成代谢流的失衡,而利用微生物自身的调控方式和调控元件,构建合... 详细信息

代谢工程是通过对代谢途径的设计、构建与优化,进行营养品、药品、生物燃料以及化工产品等各种生物基产品合成的关键技术。传统的改造策略如基因的敲除、弱化与过表达会造成代谢流的失衡,而利用微生物自身的调控方式和调控元件,构建合成调控元件,对代谢途径进行动态调控,可以平衡细胞生长与产物合成,从而实现高产量、高底物转化率与高生产强度的统一。利用微生物在转录水平对于外界环境以及胞内代谢物浓度的变化的响应机制,以及在转录后水平通过顺式及反式作用元件的调控,和在蛋白质水平通过途径酶的别构调节以及对蛋白质降解速率的调节,都能开发出相应的动态调控元件并对微生物的代谢进行动态调控。本文分别从转录水平、转录后水平及蛋白质水平3个层次总结了目前常见的一些动态调控元件,并对其在微生物代谢工程中的应用进行了介绍。

关键词：代谢工程调控元件合成生物学动态调控生物技术生化工程

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工业微生物代谢网络模型的研究进展及应用

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生物工程学报 2021年第3期37卷 860-873页

作者：张晨阳武耀康徐显皓吕雪芹李江华堵国成刘龙江南大学未来食品科技中心江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室

基因组规模代谢网络(Genome-scale metabolic network model,GSMM)是工业微生物菌株定向改造过程中一种极为重要的指导性工具,有助于研究者快速获取特定性状的工业微生物,因此越来越受到人们的关注。文中回顾了GSMM的发展历程,总结并评... 详细信息

基因组规模代谢网络(Genome-scale metabolic network model,GSMM)是工业微生物菌株定向改造过程中一种极为重要的指导性工具,有助于研究者快速获取特定性状的工业微生物,因此越来越受到人们的关注。文中回顾了GSMM的发展历程,总结并评述了GSMM的构建方法,以4种重要工业微生物(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)为例,阐述了GSMM在工业微生物中的发展与应用。此外,还对GSMM未来的发展趋势进行了展望。

关键词：典型工业微生物基因组规模代谢网络模型模型构建模型评价指标模型应用

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枯草芽孢杆菌代谢工程改造的策略与工具

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生物工程学报 2021年第5期37卷 1619-1636页

作者：吕雪芹武耀康林璐徐显皓于文文崔世修李江华堵国成刘龙江南大学未来食品科学中心江苏无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

作为一种食品安全级的典型工业模式微生物,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis由于具有非致病性、胞外分泌蛋白能力强以及无明显的密码子偏爱性等特点,现已被广泛应用于代谢工程领域。近年来,随着分子生物学和基因工程技术等的迅速发展,多... 详细信息

作为一种食品安全级的典型工业模式微生物,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis由于具有非致病性、胞外分泌蛋白能力强以及无明显的密码子偏爱性等特点,现已被广泛应用于代谢工程领域。近年来,随着分子生物学和基因工程技术等的迅速发展,多种研究策略和工具被用于构建枯草芽孢杆菌底盘细胞进行生物制品的高效合成。文中从启动子工程、基因编辑、基因回路、辅因子工程以及途径酶组装等方面介绍枯草芽孢杆菌在代谢工程领域的研究历程,并总结其在生物制品生产中的相关应用,最后对其未来的研究方向进行展望。

关键词：枯草芽孢杆菌代谢工程基因编辑基因回路

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SuperPATH入路松解梨状肌全髋关节置换术的早期疗效

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中华骨与关节外科杂志 2023年第10期16卷 907-913页

作者：甘锋平杨克勤张其标林鑫欣吴耀康谢兆林广西贵港市人民医院骨科广西贵港537100

目的:评价SuperPATH入路全髋关节置换术(THA)松解梨状肌的早期疗效。方法:选择2020年1—12月进行THA的60例患者进行前瞻性研究。采用随机数字表法随机分为2组,每组各30例。两组患者均采用SuperPATH入路进行THA,根据术中是否松解梨状肌... 详细信息

目的:评价SuperPATH入路全髋关节置换术(THA)松解梨状肌的早期疗效。方法:选择2020年1—12月进行THA的60例患者进行前瞻性研究。采用随机数字表法随机分为2组,每组各30例。两组患者均采用SuperPATH入路进行THA,根据术中是否松解梨状肌分为松解梨状肌THA组和不松解梨状肌THA组。最终松解梨状肌THA组22例患者、不松解梨状肌THA组25例患者纳入最后分析。比较两组患者手术时间(切皮开始至皮肤缝合完毕)、术中出血量、总失血量、切口长度、住院时间,术后不同时间点起立行走时间(TUG)、髋关节Harris评分、疼痛视觉模拟(VAS)评分及下肢长度差异、髋臼前倾角、髋臼外翻角,同时观察并发症发生情况。结果:松解梨状肌THA组患者手术时间较不松解梨状肌THA组患者明显缩短,且差异有统计学意义(P0.05)。松解梨状肌THA组患者术中出血量及总失血量少于不松解梨状肌THA组患者,且差异有统计学意义(P0.05)。随着时间推移,两组患者间TUG及髋关节Harris评分比较不存在主体间效应(TUG:F=0.036,P=0.850;髋关节Harris评分:F=0.151,P=0.700)。术后1个月,两组患者下肢长度差异及髋臼外翻角差异均无统计学意义(P>0.05),但不松解梨状肌THA组患者髋臼前倾角更大(P0.05]。结论:SuperPATH入路THA松解梨状肌可缩短手术时间,减少手术失血,但不影响术后早期疗效。因此建议术中对梨状肌常规进行松解。

关键词： SuperPATH入路梨状肌全髋关节置换术

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骨科老年患者术后精神障碍的相关因素分析

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临床医学 2010年第4期30卷 28-30页

作者：苏瑞鉴杨庆达曾麟杰陈善豪梁波张智钊吴耀康卢建国广西壮族自治区贵港市中西医结合骨科医院骨一区贵港537100

目的探讨骨科老年患者手术后发生精神障碍的相关因素。方法选择2006年5月至2009年5月在我科接受手术治疗的146例60岁以上老年患者,按术后有无精神症状分为有症状组和无症状组。其中有症状组17例,年龄63～104岁,平均(74±8)岁;无症状组12... 详细信息

目的探讨骨科老年患者手术后发生精神障碍的相关因素。方法选择2006年5月至2009年5月在我科接受手术治疗的146例60岁以上老年患者,按术后有无精神症状分为有症状组和无症状组。其中有症状组17例,年龄63～104岁,平均(74±8)岁;无症状组129例,年龄60～86岁,平均(68±6)岁。结果发现有症状组在年龄,吸入麻醉方式及时间,术中失血量,术后低血色素及低氧血症,水、电解质紊乱,术前合并糖尿病、高血压病、脑血管疾病、呼吸系统疾病等因素与无症状组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨科老年患者手术后发生精神障碍与年龄,吸入麻醉方式及时间,术中失血量,术后低血色素及低氧血症,水、电解质紊乱,术前合并糖尿病、高血压病、脑血管疾病、呼吸系统疾病等因素有关。

关键词：骨科老年患者手术后精神障碍

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Solution process formation of high performance,stable nanostructured transparent metal electrodes via displacement-diffusion-etch process

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npj Flexible Electronics 2022年第1期6卷 20-27页

作者： yaokang Zhang Xuyun Guo Jiaming Huang Zhiwei Ren Hong Hu Peng Li Xi Lu Zhongwei wu Ting Xiao Ye Zhu Gang Li Zijian Zheng Laboratory for Advanced Interfacial Materials and Devices Institute of Textiles and Clothingthe Hong Kong Polytechnic UniversityHong KongChina Department of Applied Physics the Hong Kong Polytechnic UniversityHong KongChina Department of Electronic and Information Engineering Research Institute for Smart Energythe Hong Kong Polytechnic UniversityHong KongChina

Transparent electrodes(TEs)with high chemical stability and excellent flexibility are critical for flexible optoelectronic devices,such as photodetectors,solar cells,and light-emitting *** metal electrode(thickness less than 20 nm)has been a promising TE candidate,but the fabrication can only be realized by vacuum-based technologies to date,and require tedious surface engineering of the substrates,which are neither ideal for polymeric based flexible applications nor suitable for roll-to-roll large-scale *** paper presents high-performance nanostructured transparent metal electrodes formation via displacement-diffusion-etch(DDE)process,which enables the solution-processed sub-20-nm-thick ultrathin gold electrodes(UTAuEs)on a wide variety of hard and soft *** fabricated on flexible polyethylene terephthalate(PET)substrates show a high chemical/environmental stability and superior bendability to commercial flexible indiumtin-oxide(ITO)***,flexible organic solar cells made with UTAuEs show similar power conversion efficiency but much enhanced flexibility,in comparison to that of ITO-based devices.

关键词： transparent displacement diffusion

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金耳多糖浸膏喷雾干燥工艺研究

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中国药业 2008年第17期17卷 37-38页

作者：吴晓宁熊耀康浙江医学高等专科学校浙江杭州310053 浙江中医药大学浙江杭州310053

目的对金耳多糖浸膏的喷雾干燥工艺进行优选。方法采用正交试验法,以含水量为考察指标,对影响喷雾干燥的因素进行考察,确定最佳喷雾干燥工艺。结果喷雾干燥机进风温度和输液泵开裂对试验结果有影响,浸膏相对密度对试验结果无影响。结论... 详细信息

目的对金耳多糖浸膏的喷雾干燥工艺进行优选。方法采用正交试验法,以含水量为考察指标,对影响喷雾干燥的因素进行考察,确定最佳喷雾干燥工艺。结果喷雾干燥机进风温度和输液泵开裂对试验结果有影响,浸膏相对密度对试验结果无影响。结论金耳多糖浸膏的最佳干燥工艺条件为浸膏相对密度1.04,进口温度180℃,输液泵开裂70%。

关键词：金耳多糖浸膏喷雾干燥正交试验法

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金耳多糖胶囊成型工艺的研究

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浙江中医药大学学报 2008年第4期32卷 520-522页

作者：吴晓宁熊耀康浙江医学高等专科学校杭州310053 浙江中医药大学

[目的]优选金耳多糖胶囊最佳成型工艺。[方法]通过对金耳多糖粉末及其与不同辅料混合的内容物的粒径、流动性、堆密度、吸湿百分率等项目比较实验,筛选最佳辅料,并确定囊壳及装量。[结果]胶囊最终选择为粗多糖:磷酸氢钙1∶0.1,选用0号胶... 详细信息

[目的]优选金耳多糖胶囊最佳成型工艺。[方法]通过对金耳多糖粉末及其与不同辅料混合的内容物的粒径、流动性、堆密度、吸湿百分率等项目比较实验,筛选最佳辅料,并确定囊壳及装量。[结果]胶囊最终选择为粗多糖:磷酸氢钙1∶0.1,选用0号胶囊,装量为0.245g。[结论]该工艺可应用于生产。

关键词：金耳多糖胶囊粒径流动性堆密度吸湿百分率

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