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携带猪流行性腹泻病毒抗原表位的铁蛋白纳米颗粒制备与免疫原性分析

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中国畜牧兽医 2023年第4期50卷 1567-1574页

作者：刘家兴韩雪英张鑫茹邓嘉昕姚伦广刘阳坤南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南省畜禽保健品工程技术中心南阳473061 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

【目的】制备携带猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫原性,为PEDV的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】将PEDV纤突蛋白S的COE和S1D区域设计成串联表位S1CD并进行密码子... 详细信息

【目的】制备携带猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫原性,为PEDV的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】将PEDV纤突蛋白S的COE和S1D区域设计成串联表位S1CD并进行密码子优化和合成,构建单独表达S1CD蛋白的重组质粒pET28a-S1CD及融合表达S1CD蛋白和铁蛋白亚基的重组质粒pET28a-S1CD-Ferritin,并在大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1CD、S1CD-Ferritin蛋白在大肠杆菌内是否正确表达,并通过透射电镜观察其形态结构。将纯化的S1CD-Ferritin蛋白免疫小鼠,同时以纯化的S1CD蛋白和PBS为对照,采用间接ELISA方法检测各组小鼠血清的S特异性抗体水平和γ-干扰素(IFN-γ)含量,通过中和试验测定中和抗体水平,分析重组蛋白在小鼠体内的免疫原性。【结果】成功构建了重组质粒pET28a-S1CD和pET28a-S1CD-Ferritin。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了S1CD和S1CD-Ferritin重组蛋白,大小分别约为22和39 ku,均以包涵体形式存在。Western blotting鉴定结果显示,S1CD和S1CD-Ferritin蛋白均与PEDV阳性血清发生特异性反应,表明原核表达得到的S1CD和S1CD-Ferritin重组蛋白具备良好的反应原性。透射电镜结果显示,纯化后的S1CD-Ferritin蛋白可形成大小均一、粒径为12~20 nm的球形颗粒,表明S1CD-Ferritin蛋白已成功组装为纳米颗粒。血清抗体检测结果显示,首次免疫7 d后,S1CD-Ferritin蛋白免疫组抗体水平迅速提高,显著高于S1CD蛋白免疫组(P<0.05);首次免疫28 d后,S1CD-Ferritin蛋白免疫组的中和抗体水平及IFN-γ含量均显著高于S1CD蛋白免疫组(P<0.05)。【结论】融合铁蛋白的PEDV抗原表位在大肠杆菌中得到高效表达,并能自组装形成纳米颗粒,显著增强目的抗原的免疫原性,为研究新的PEDV亚单位疫苗拓宽了研究思路。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV) 铁蛋白纳米颗粒原核表达免疫原性

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D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成

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应用化学 2020年第2期37卷 168-174页

作者：史红玲王文杰李祥焦铸锦刘钺唐存多阚云超姚伦广南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室和河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室河南南阳473061 南阳师范学院车用生物燃料技术国家重点实验室河南南阳473061

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓... 详细信息

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)浓度、NH+4浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD^+、0.5 mol/L NH4^+的条件下、30℃,反应12h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。

关键词： L-苯甘氨酸 D-扁桃酸脱氢酶 L-亮氨酸脱氢酶生物催化级联反应

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河南省鸟类新纪录—褐胸鹟

野生动物学报 2020年第3期41卷 835-837页

作者：肖凯丽杨康强闫满玉邓天鹏姚伦广阮晓晖梁子安南阳师范学院生命科学与技术学院南水北调中线水源区水安全河南省协同创新中心南阳473061 河南省宝天曼国家级自然保护区管理局南阳474350 河南省丹江湿地国家级自然保护区管理处南阳474450

2019年5月29日,在河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园进行观鸟活动时,发现1只雀形目鸟类,经查阅相关文献,最后确认其为褐胸鹟(Muscicapa muttui),系河南省鸟类分布新纪录。

关键词：河南省新纪录褐胸鹟

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纳米BiOBr对羊角月牙藻的毒性效应

环境科学学报 2018年第10期38卷 4176-4184页

作者：程晓燕赵新仕叶立群马照宇李玉英付玲姚伦广南阳师范学院南水北调中线水源区水安全河南省协同创新中心河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室南阳473061

纳米BiOBr(n-BiOBr)是具有广泛应用前景的高活性光催化材料,由于n-BiOBr能在可见光区响应,一旦进入水环境将会造成严重的水生态安全隐患.为探究n-BiOBr对藻类的毒性效应及机理,以羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)为受试生物... 详细信息

纳米BiOBr(n-BiOBr)是具有广泛应用前景的高活性光催化材料,由于n-BiOBr能在可见光区响应,一旦进入水环境将会造成严重的水生态安全隐患.为探究n-BiOBr对藻类的毒性效应及机理,以羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)为受试生物,研究n-BiOBr对羊角月牙藻生长状况、光合色素、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及脂质过氧化物丙二醛(MDA)的影响.结果表明,n-BiOBr对羊角月牙藻的生长有抑制作用,72 h半数效应浓度(EC_(50))为7.407 mg·L^(-1). n-BiOBr处理藻细胞72 h后,藻细胞的叶绿素总量及叶绿素a/b值随着n-BiOBr浓度的升高而降低,呈现一定的浓度-效应关系.随着n-BiOBr浓度增加,MDA、SOD和CAT活性呈现"升高-降低"的趋势.本研究可为纳米材料的科学、有效、无害化应用和管理提供理论依据.

关键词：纳米BiOBr 羊角月牙藻生长抑制光合色素氧化压力

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GⅡ.17型诺如病毒样颗粒的制备及鉴定

微生物学通报 2022年第2期49卷 483-491页

作者：王竹叶韩雪英王国川黄克李娜姚伦广刘阳坤南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南省畜禽保健品工程技术中心河南南阳473061 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

[背景]诺如病毒(Norovirus,NoV)是引发全球人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,具有广泛的遗传多样性,其中GⅡ.17型是亚洲地区的优势流行株,危害最为严重。研究表明,通过基因工程技术制备的诺如病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)具有... 详细信息

[背景]诺如病毒(Norovirus,NoV)是引发全球人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,具有广泛的遗传多样性,其中GⅡ.17型是亚洲地区的优势流行株,危害最为严重。研究表明,通过基因工程技术制备的诺如病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)具有良好的免疫保护作用,是目前NoV疫苗研发的主要思路。[目的]利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统制备GⅡ.17型诺如病毒的VLP,为GⅡ.17型NoV疫苗的研发奠定基础。[方法]合成GⅡ.17型NoV衣壳蛋白VP1的基因并克隆入pET28a-MsyB原核表达质粒中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,通过烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶去除融合标签,利用His-Tag镍柱纯化获得天然VP1蛋白,利用SDS-PAGE、Western Blot和透射电镜对纯化后的VP1蛋白反应原性及其形成的结构进行初步鉴定。[结果]MsyB-VP1融合蛋白能够以可溶形式大量表达,其最适表达条件为:IPTG浓度0.8 mmol/L,37℃诱导8 h;TEV蛋白酶酶切后的VP1纯化蛋白能够与鼠抗GⅡ.17型NoV VP1多克隆抗体特异性结合,并能够自组装形成直径约为40 nm的病毒样颗粒。[结论]利用原核表达系统成功制备了GⅡ.17型诺如病毒VLP,有望成为GⅡ.17型诺如病毒的候选疫苗。

关键词：诺如病毒 GⅡ.17型病毒样颗粒原核表达

1株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

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河南农业科学 2017年第8期46卷 131-136页

作者：李晓楠唐青海李羽王瑾姚伦广阚云超杨海南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室/昆虫生物反应器河南省工程实验室河南南阳473061 衡阳师范学院生命科学与环境学院/生物药物研究所湖南衡阳421008

采集1例疑似感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)仔猪的粪便,运用RT-PCR方法和血清学方法对病料进行TGEV检测,并应用猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和RT-PCR方法检测病毒在ST细胞中的增殖动态,应... 详细信息

采集1例疑似感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)仔猪的粪便,运用RT-PCR方法和血清学方法对病料进行TGEV检测,并应用猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和RT-PCR方法检测病毒在ST细胞中的增殖动态,应用RT-PCR方法扩增分离TGEV S1基因,经序列测定后,采用DNAStar 7.0和Mega 5.0软件对TGEV进行生物信息学分析。结果表明,病料接种到ST细胞培养后,出现明显细胞病变效应(CPE);RT-PCR检测结果显示,TGEV核酸阳性;血清学鉴定TGEV抗原阳性。将分离毒株命名为TGEV-NY。感染12 h后,IPMA检测结果阳性,且可从细胞培养上清中检出TGEV核酸。序列测定分析表明,分离毒株S1基因开放阅读框(ORF)为2 220 bp,编码740个氨基酸。进化分析显示,分离毒株与我国2006年分离的SC-Y毒株亲缘关系最近,分离毒株属于基因Ⅰ群。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒分离培养免疫过氧化物酶单层细胞染色法

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1抗原表位的串联表达及免疫原性分析

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黑龙江畜牧兽医 2023年第15期 1-7,129页

作者：刘阳坤王国川韩雪英冷超粮姚伦广南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南南阳473061 河南省畜禽保健品工程技术中心河南南阳473061 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白S1抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性,试验将S1蛋白的抗原表位COE和S1D连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体pFastBac1上,然后... 详细信息

为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白S1抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性,试验将S1蛋白的抗原表位COE和S1D连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体pFastBac1上,然后转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR扩增筛选重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-S1CD,再转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,采用间接免疫荧光试验和Western-blot检测方法鉴定重组蛋白S1CD的表达情况。将小鼠随机均分为S1CD蛋白组、PEDV灭活疫苗组和PBS组,分别经背部皮下多点注射重组蛋白S1CD、PEDV HeN170821灭活病毒和PBS与弗氏佐剂等体积混合制成的抗原,检测特异性IgG抗体水平及白细胞介素-4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)含量以评价重组蛋白S1CD的免疫原性。结果表明:重组蛋白S1CD成功在Sf9昆虫细胞中表达,并能与鼠抗His单克隆抗体和PEDV阳性血清发生特异性反应;首次免疫后第28天,S1CD蛋白组的特异性IgG抗体水平极显著高于PBS组(P<0.01);首次免疫后第42天,S1CD蛋白组的特异性IgG抗体水平及IL-4和IFN-γ含量均极显著高于PBS组(P<0.01)。说明利用杆状病毒表达系统表达的重组蛋白S1CD具有良好的免疫原性。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV) S1蛋白抗原表位串联表达免疫原性

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河南省某小型猪场废水中细菌耐药性调查

河南师范大学学报（自然科学版） 2021年第1期49卷 80-86页

作者：秦会玲常导刘阳坤章伟成付玲李娜姚伦广南阳师范学院南水北调中线水源区水安全河南省协同创新中心河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室河南南阳473061

由于我国畜牧养殖业中抗生素长期使用,导致了养殖废水中的抗生素耐药菌(antibioticresistant bacteria,ARB)的大量出现以及抗生素抗性基因(antibioticresistantgene,ARG)的污染,给周边水源以及生态环境带来了巨大的风险.为调查河南区域... 详细信息

由于我国畜牧养殖业中抗生素长期使用,导致了养殖废水中的抗生素耐药菌(antibioticresistant bacteria,ARB)的大量出现以及抗生素抗性基因(antibioticresistantgene,ARG)的污染,给周边水源以及生态环境带来了巨大的风险.为调查河南区域小型养猪场废水中细菌的耐药性和抗生素抗性基因存在情况,对某小型猪场8个取样点的污水及底泥样品进行检测.利用抗生素药敏试验调查了废水中细菌的耐药性及PCR扩增技术检测抗生素抗性基因的存在情况.结果表明:(1)母猪舍、仔猪舍、育肥舍、妊娠舍和产房5个采样点的废水中细菌的耐药率较高,在经过处理后污水池和沉淀池废水中细菌耐药率显著下降,但与自然环境相比依然较高;(2)四环素类、磺胺类及氨基糖苷类抗生素抗性基因在猪场和生活区细菌中均有较高的检出率,可能在环境中发生迁移,进入附近生活水源区.该研究的调查数据为规范小型养猪场中抗生素的合理使用和进一步展开小规模养猪场中抗生素抗性细菌和抗性基因的污染研究提供了参考.

关键词：养猪废水抗生素耐药性抗生素抗性基因抗生素耐药细菌

3株传染性支气管炎病毒蛋鸡源河南株的S1基因序列分析

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河南农业科学 2019年第6期48卷 123-130页

作者：吴倩倩许鑫陈钦玺阚云超姚伦广王新卫冀君南阳师范学院南阳市兽医生物工程技术研究中心/河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室河南南阳473061 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

为了解河南省致蛋鸡产蛋量下降的传染性支气管炎病毒(IBV)的流行特征,从河南南阳、信阳和安阳等市的发病鸡场中鉴定出3株IBV,分别命名为CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018,并应用RT-PCR技术对3个IBV分离... 详细信息

为了解河南省致蛋鸡产蛋量下降的传染性支气管炎病毒(IBV)的流行特征,从河南南阳、信阳和安阳等市的发病鸡场中鉴定出3株IBV,分别命名为CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018,并应用RT-PCR技术对3个IBV分离株的S1基因进行扩增与序列分析。结果显示,3个IBV分离株S1基因全长都为1617nt,编码539aa,并且都属于基因型4/91(CHⅡ);CK/CH/HN/NY1206/2017株S1基因裂解位点为RRSRR,CK/CH/HN/XY911/2017株S1基因裂解位点为RRSRR,CK/CH/HN/AY119/2018株S1基因裂解位点为RRFRR;3个分离株间核苷酸序列及其推导的氨基酸序列具有较高同源性,与位于同一基因型的参考毒株间同源性较高,与我国使用的Mass型常规疫苗H120和H52株的核苷酸和氨基酸同源性最低,分别仅为78.3%~78.4%和74.8%~75.4%,与4/91(CHⅡ)型疫苗4/91株的核苷酸和氨基酸同源性较高,分别达到94.7%~99.3%和93.9%~98.1%。综上,河南省致蛋鸡产蛋量下降的IBV流行株基因型相对统一,使用4/91(CHⅡ)型疫苗应可提高蛋鸡抗IBV的效率。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 S1基因序列分析基因型河南省