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Efficient purification of cell culture-derived classical swine fever virus by ultrafiltration and size-exclusion chromatography

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Frontiers of Agricultural Science and Engineering 2015年第3期2卷 230-236页

作者： Ruining WANG Yubao ZHI Junqing GUO Qingmei LI Li WANG Jifei YANG Qianyue JIN Yinbiao WANG Yanyan YANG guangxu xing Songlin QIAO Mengmeng ZHAO Ruiguang DENG Gaiping ZHANG College of Animal Science and Veterinary Medicine Henan Agricultural UniversityZhengzhou 450002China Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture Henan Provincial Key Laboratory of Animal ImmunologyHenan Academy of Agricultural SciencesZhengzhou 450002China

Large-scale production of cell culture-based classical swine fever virus(CSFV)vaccine is hampered by the adverse reactions caused by contaminants from host cell and culture ***,we have developed an efficient method for purifying CSFV from cell-culture *** viral particles were obtained with two steps of tangential-flow filtration(TFF)and size-exclusion chromatography(SEC),and were compared with particles from ultracentrifugation by transmission electron microscopy(TEM),infectivity and recovery test,and real time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR).TFF concentrated the virus particles effectively with a retention rate of 98.5%,and 86.2%of viral particles were obtained from the ultrafiltration retentate through a Sepharose 4 F F column on a biological liquid chromatography *** purified by TFF-SEC or ultracentrifugation were both biologically active from 1.0×10–4.25 TCID50·mL^(–1) to 3.0×10^(–6.25) TCID50·mL^(–1),but the combination of TFF and SEC produced more pure virus particles than by ultracentrifugation *** addition,pure CSFV particles with the expected diameter of 40–60 nm were roughly spherical without any visible *** immunized with CSFV purified by TFF-SEC produced higher antibody levels compared with immunization with ultracentrifugation-purified CSFV(P<0.05).The purification procedures in this study are reliable technically and feasible for purification of large volumes of viruses.

关键词： classical swine fever virus virus purification tangential-flow filtration size-exclusion chromatography

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Establishment of Indirect ELISA Diagnosis Technique based on the VP1 Protein of Foot and Mouth Disease Virus Serotype A

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Animal Husbandry and Feed Science 2014年第6期6卷 300-303,311页

作者： Lu Qingxia Liu Chang Jin Qianyue Guo Guanpeng xing guangxu Liu Yunchao Deng Ruiguang Zhang Gaiping Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture/Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology Henan Academy of Agricultural Sciences College of Veterinary Medicine and Animal Science Henan Agricultural University

The VP1 protein of foot-and-mouth disease virus serotype A was prokaryotically expressed and purified to replace the traditional virus antigen for estab- lishing a fast, safe, effective indirect ELISA method, so as to detecting antibody of foot-and-mouth disease virus serotype A. Western-Blot test showed that the VP1 recombinant protein could be used as detective antigen as it can be specifically recognized by bovine positive serum of FMDV serotype A. By employing matrix titra- tion method, the optimal parameters were obtained as follows： 1 mg/L VP1 protein as coating antigen, Vserum：Vblocking solution = 1：50 dilution for serum and Vsecondary enzyme-linked antibedies：Vblocking solution ---1：2 000 for enzyme combined antibodies. The results showod that the sensitivity and specificity of this method were 94.32% and 99.09% respectively, the coefficients of variations in intra-assay and inter-assay reproducibility tests was lower than 8%. Compared with liquid phase blocking ELISA kits, the agreement of 201 serum samples reached 92.54%. The VP1-ELISA method established here is specific, sensitive, stable and simple, which can be used to monitor the antibody level of FMD serotype A.

关键词： Foot and mouth disease virus serotype A VP1 protein Indirect ELISA

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玉米赤霉烯酮荧光免疫层析快速检测方法的研究

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畜牧与兽医 2022年第8期54卷 105-109页

作者：邢广旭邢云瑞孙亚宁范璐张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 江苏高校动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心/扬州大学江苏扬州225009

为了建立更灵敏的玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)快速检测方法,以量子点(quantum dots,QDs)为标记材料,利用活泼酯法标记ZEN单克隆抗体制备荧光免疫探针,以ZEN-BSA为检测线,成功制备了ZEN荧光免疫层析试纸。结果表明,该试纸回归方程为y=... 详细信息

为了建立更灵敏的玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)快速检测方法,以量子点(quantum dots,QDs)为标记材料,利用活泼酯法标记ZEN单克隆抗体制备荧光免疫探针,以ZEN-BSA为检测线,成功制备了ZEN荧光免疫层析试纸。结果表明,该试纸回归方程为y=-0.5325x+0.9372,IC_(50)为6.6 ng/mL,检测限为1.2 ng/mL;与玉米赤霉酮(ZAN)交叉反应率为88.2%,与其他结构类似物交叉反应率均小于10%,与常见真菌毒素黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、T-2均无交叉反应;玉米样品加标回收率为86.4%~108.5%,变异系数小于15%;通过高效液相色谱(HPLC)法确证,本研究建立的荧光免疫层析试纸条可用于玉米中ZEN的快速筛查。

关键词：玉米赤霉烯酮量子点免疫层析试纸玉米

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猪流行性腹泻病毒E蛋白诱发细胞未折叠反应的分子机制

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畜牧与兽医 2022年第9期54卷 60-65页

作者：邢广旭焦文强王方雨张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学江苏扬州225009 河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南郑州450002 河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室河南郑州450002

为阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV) E蛋白诱导Vero-E6细胞内质网应激分子机制,采用RT-PCR方法扩增得到E蛋白基因,经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后与同样酶切的p-EGFP-N1载体使用T4 DNA连接酶进行连接,成功构建了表达载体,与pCDNA 3.1-GRP78共转染Vero... 详细信息

为阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV) E蛋白诱导Vero-E6细胞内质网应激分子机制,采用RT-PCR方法扩增得到E蛋白基因,经XhoⅠ和BamHⅠ酶切后与同样酶切的p-EGFP-N1载体使用T4 DNA连接酶进行连接,成功构建了表达载体,与pCDNA 3.1-GRP78共转染Vero-E6细胞,通过激光共聚焦试验和Western blot验证E蛋白的细胞定位,并揭示其激活细胞内质网应激的分子机制。结果表明,通过共聚焦荧光显微镜证实E蛋白定位在细胞中,Western blot方法验证E蛋白可以上调Vero-E6细胞GRP78蛋白表达水平,诱导Vero细胞内质网应激。进一步采用Western blot验证E蛋白通过PERK-eIF2α信号通路激活未折叠蛋白反应。本研究为探究PEDV致病机制提供了新的思路。

关键词：猪流行性腹泻病毒 E蛋白信号通路

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基于局域表面等离子体共振(LSPR)的核酸适配体筛选新方法的建立

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河南农业科学 2020年第3期49卷 151-156页

作者：郝俊芳张英涛邢广旭王方雨河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 四川农业大学动物医学院禽病研究中心四川成都611130 河南省科学院生物研究所有限责任公司河南郑州450008

为了快速、高效地筛选到靶标核酸适配体,急需通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)建立一种简便、高效和可视化筛选适配体的新方法.以链霉亲和素(SA)作为靶标模型,利用局域表面等离子体共振(LSPR)和毛细管电泳(CE)相结合的方法进行筛... 详细信息

为了快速、高效地筛选到靶标核酸适配体,急需通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)建立一种简便、高效和可视化筛选适配体的新方法.以链霉亲和素(SA)作为靶标模型,利用局域表面等离子体共振(LSPR)和毛细管电泳(CE)相结合的方法进行筛选和验证.结果显示,在第1轮LSPR-SELEX中,筛选到SA结合的适配体(SBA),并且通过LSPR的Trace Drawer数据分析软件计算出SBA的KD值为107μmol/L;在第2轮LSPR-SELEX中,SBA的KD值为98 nmol/L.结果表明,采用LSPR-SELEX技术经2轮筛选,使SBA的亲和力提高了1000倍.随后,将筛选到的SBA进行CE验证,结果显示,SBA适配体与其靶标SA具有良好的亲和性和特异性.综上,鉴于LSPR从初始DNA文库中分离和收集靶标适配体的高效性,LSPR-SELEX技术可用于核酸适配体的筛选.

关键词：适配体 LSPR-SELEX 链霉亲和素毛细管电泳 KD值

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侧流胶体金免疫试纸快速测定牛奶中的泰乐菌素

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食品与发酵工业 2022年第12期48卷 261-266页

作者：邢广旭孙雪峰赵东杨继飞赵雅丽张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学食品科学技术学院河南郑州450002

大环内酯类抗生素是非常重要的一类抗菌化合物,而泰乐菌素(tylosin,TYL)是最常用的预混大环内酯类抗生素。但是,这些药物的残留物会在人体中引起过敏反应,并对抗生素产生抗药性。为了评估TYL的残基,需要灵敏的分析方法以确保低浓度下的... 详细信息

大环内酯类抗生素是非常重要的一类抗菌化合物,而泰乐菌素(tylosin,TYL)是最常用的预混大环内酯类抗生素。但是,这些药物的残留物会在人体中引起过敏反应,并对抗生素产生抗药性。为了评估TYL的残基,需要灵敏的分析方法以确保低浓度下的测定。该文开发了一种快速免疫层析侧流试纸条,用于专门测定牛奶样品中的TYL残留。该文筛选了抗TYL单克隆抗体。抗体滴度为2.56×10^(-5),IC_(50)为4.6091 ng/mL。该测试条由样品垫、共轭垫、包含质控线和线的硝酸纤维素(nitrocellulose membrane,NC)膜以及吸收垫组成。用试纸条测定TYL的不同标准样品(0、2、4、8、16、32、64 ng/mL)。用扫描仪计算出试纸的检出限(limit of detection,LOD)为1.5434 ng/mL,肉眼计算为10 ng/mL,计算其IC_(50)为7.8362 ng/mL,无需特殊设备,测试结果将在20 min内获得。牛奶的平行分析显示从试纸条和HPLC获得的结果相当,试纸与其他兽药无交叉反应。因此,该试纸条非常简便快捷,可作为定量、半定量或定性检测牛奶中TYL残留的筛选方法。

关键词：牛奶泰乐菌素单克隆抗体免疫层析法侧流试纸

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磺胺甲恶唑人工抗原的合成与鉴定

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家畜生态学报 2017年第9期38卷 66-71页

作者：宋予震董青邢广旭胡骁飞吕全建柳巨雄河南牧业经济学院动物医学院河南郑州450046 吉林大学动物医学学院吉林长春130062 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为检测磺胺甲恶唑(SMZ)的残留,用重氮化方法将SMZ偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成了免疫抗原BSA-SMZ和包被抗原OVA-SMZ。经紫外扫描、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清;利用间接ELISA法测定多抗血清效价,竞争ELISA测定多... 详细信息

为检测磺胺甲恶唑(SMZ)的残留,用重氮化方法将SMZ偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成了免疫抗原BSA-SMZ和包被抗原OVA-SMZ。经紫外扫描、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清;利用间接ELISA法测定多抗血清效价,竞争ELISA测定多抗血清的敏感性和特异性。结果表明,所合成的免疫抗原效果较好,6只免疫小鼠多抗血清的效价均大于1∶1.28×104,5号小鼠的多抗血清敏感性最高,半数抑制浓度为47.1ng/mL,与其他磺胺类药物无交叉反应,具备良好的特异性。试验成功合成了SMZ人工抗原,并制得了敏感性高、特异性好的鼠源多抗血清,为SMZ单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

关键词：磺胺甲恶唑人工抗原合成鉴定

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酶联免疫法检测猪肉中的司帕沙星

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现代食品科技 2022年第2期38卷 266-271页

作者：邢广旭赵东孙雪峰温留丁张颖硕张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450003

为了建立一种检测猪肉中司帕沙星(SPFX)残留的方法,并且在检测时具有特异性高,背景低和无需样品预处理的特点。该研究制备了间接竞争性酶联免疫吸附剂和特异性抗司帕沙星单克隆抗体。结果表明,该抗体与氟甲喹(11.99%)、氟罗沙星(11.14%... 详细信息

为了建立一种检测猪肉中司帕沙星(SPFX)残留的方法,并且在检测时具有特异性高,背景低和无需样品预处理的特点。该研究制备了间接竞争性酶联免疫吸附剂和特异性抗司帕沙星单克隆抗体。结果表明,该抗体与氟甲喹(11.99%)、氟罗沙星(11.14%)、恩诺沙星(4.60%)、环丙沙星(0.31%)几乎没有交叉反应。该方法测定了添加SPFX的猪肉中的药物残留,检测内变异系数小于5.68%,检测间变异系数小于5.51%。检测间和检测内的平均回收率分别为102%~106%和101%~104%。该抗体对SPFX的IC_(50)为31μg/L,没有抗体具有四种结构相关化合物和其他化合物。高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的结果进一步证实了icELISA快速检测猪肉中SPFX的可靠性和准确性。该研究表明icELISA法检测猪肉中SPFX残留分析是一种可靠、简便、低成本的方法。

关键词：司帕沙星单克隆抗体酶联免疫吸附试验猪肉

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变频器在高层民用建筑给水泵房中的应用

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电子测试 2016年第1期27卷 117-118页

作者：吴红梅邢广旭侯云璐大连市自来水集团设计有限公司辽宁大连116600

随着城市用地的紧张,小区高层建筑越来越多,高层建筑的给水设计就愈加显得重要。给水一旦失去控制,必然给居民的生活和工作带来很大的麻烦,甚至造成财产损失。因此,必须严格按照国家规范规程做好民用建筑给水泵房的供电及电气控制设计... 详细信息

随着城市用地的紧张,小区高层建筑越来越多,高层建筑的给水设计就愈加显得重要。给水一旦失去控制,必然给居民的生活和工作带来很大的麻烦,甚至造成财产损失。因此,必须严格按照国家规范规程做好民用建筑给水泵房的供电及电气控制设计工作。

关键词：变频器高层给水泵房应用

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免疫分析方法在磺胺类药物残留检测中的应用

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河南农业科学 2017年第10期46卷 8-12页

作者：宋予震董青邢广旭胡骁飞吕全建柳巨雄吉林大学动物医学学院吉林长春130062 河南牧业经济学院动物医学院河南郑州450046 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

磺胺类药物是一类常用的广谱型抗菌药,主要用于预防和治疗细菌感染性疾病,并可作为添加剂在动物饲料中长期添加。但磺胺类药物的不规范使用会导致不同程度的药物残留,从而引起生态环境污染,威胁人类健康。磺胺类药物在人体内蓄积会引起... 详细信息

磺胺类药物是一类常用的广谱型抗菌药,主要用于预防和治疗细菌感染性疾病,并可作为添加剂在动物饲料中长期添加。但磺胺类药物的不规范使用会导致不同程度的药物残留,从而引起生态环境污染,威胁人类健康。磺胺类药物在人体内蓄积会引起过敏反应、造血功能紊乱、肾脏损伤等。因此,研究简单快速、灵敏度高、特异性强的磺胺类药物残留检测方法十分必要。免疫分析方法利用高亲和力抗体对抗原进行特异性识别,是近几年磺胺类药物残留快速检测的研究热点。综述了放射性免疫、化学发光免疫、酶联免疫、免疫层析、免疫传感器等免疫分析方法在磺胺类药物残留快速检测中的应用,并对免疫分析方法今后的发展进行展望。

关键词：磺胺类药物免疫分析残留检测

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