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多酶级联反应催化γ-丁内酯生成1,4-丁二醇

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应用与环境生物学报 2024年第1期30卷 167-175页

作者：郭艺鸣姜君逸潘学玮张显徐美娟杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇... 详细信息

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)

关键词：多酶级联转化辅酶循环再生 γ-丁内酯 1,4-丁二醇

Cascade biocatalysis for production of enantiopure(S)-2-hydroxybutyric acid using recombinant Escherichia coli with a tunable multi-enzyme-coordinate expression system

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Systems Microbiology and Biomanufacturing 2021年第2期1卷 234-244页

作者： Lingzhi Tian Junping Zhou taowei yang Xian Zhang Meijuan Xu Zhiming Rao The Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of EducationSchool of BiotechnologyJiangnan UniversityWuxi 214122Jiangsu ProvinceChina

Racemize 2-hydroxybutyric acid is usually synthesized by organic methods and needs additional deracemization to obtain optically pure enantiomers for industrial *** we present a cascade biocatalysis system in Escherichia coli BL21 which employed L-threonine deaminase(TD),NAD-dependent L-lactate dehydrogenase(LDH)and alcohol dehydrogenase(ADH)for producing optically pure(S)-2-hydroxybutyric acid((S)-2-HBA)from bulk chemical *** solve the mismatch in the conversion rate and the consumption rate of intermediate 2-oxobutyric acid(2-OBA)formed in the multi-enzyme catalysis reaction,ribosome binding site regulation strategy was explored to control TD expression levels,achieving an eightfold alteration in the conversion rate of *** the optimized activity ratio of the three enzymes and using ADH for NADH regeneration,the recombinant strain ADH-r53 showed increased production of(S)-2-HBA with the highest titer of 129 g/L and molar yield of 93%within 24 h,which is approximately 1.65 times that of the highest yield reported so ***,(S)-2-HBA could easily be purified by distillation,making it have great potential for industrial ***,our results indicated that constructing a tunable multi-enzyme-coordinate expression system in single cell had great significance in biocatalysis of hydroxyl acids.

关键词： Cascade biocatalysis (S)-2-hydroxybutyric acid Multi-enzyme-coordinate expression system NADH regeneration Ribosome binding site strength

Comparative transcriptome analysis reveals metabolic regulation of prodigiosin in Serratia marcescens

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Systems Microbiology and Biomanufacturing 2021年第3期1卷 323-335页

作者： yang Sun Lijun Wang Tolbert Osire Weilai Fu Ganfeng Yi Shang-Tian yang taowei yang Zhiming Rao The Key Laboratory of Industrial Biotechnology School of BiotechnologyJiangnan UniversityMinistry of Education1800 Lihu AvenueWuxiJiangsu 214122P.R.China Fujian Dabeinong Aquatic Sci.&Tech.Co. Ltd.Zhangzhou 363500FujianChina Department of Chemical and Biomolecular Engineering The Ohio State UniversityColumbusOH 43210USA

Prodigiosin is a secondary metabolite mainly produced at 30°C in Serratia marcescens,but it can hardly be synthetized at 37°C or *** this study,we provide insight into the metabolic regulation of prodigiosin synthesis in response to temperature through transcriptome *** analysis of the function of differentially expressed genes suggested that temperature resulted in significant alteration of the metabolic pathways between 30 and 37°***,30°C favored transcriptional expression of the pig gene *** the same time,the carbon flux was redistributed to pathways of pyruvate,proline,serine,especially homoserine,cystathionine,homocysteine,methionine,and s-adenosylmethionine metabolism,all involved in prodigiosin biosynthesis,and was finally increased towards the prodigiosin synthesis pathway in *** at 30°***,results further confirmed increased transcriptional level of five regulators(LuxS,RpoS,Hfq,EepR,CRP),and decreased content of hexS through ***,successful co-overexpression of mmuM and metK,related to homocysteine,methionine,and s-adenosylmethionine metabolism,in the chromosome of JNB5-1(JNB5-1/MK)resulted in increased prodigiosin titer up to 7.57 g/L in JNB5-1/MK at 30°C,which was 41.2%higher than that in *** transcriptome analysis provides further insight into the strain’s response to temperature changes at the transcription level,which is of great significance for improving the production of prodigiosin.

关键词： S.marcescens Prodigiosin Transcriptome Temperature-dependent Metabolic regulation

Abrogation of Hn RNP L enhances anti-PD-1 therapy efficacy via diminishing PD-L1 and promoting CD8^(+) T cell-mediated ferroptosis in castration-resistant prostate cancer

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2022年第2期12卷 692-707页

作者： Xumin Zhou Libin Zou Hangyu Liao Junqi Luo taowei yang Jun Wu Wenbin Chen Kaihui Wu Shengren Cen Daojun Lv Fangpeng Shu Yu yang Chun Li Bingkun Li Xiangming Mao Department of Urology Zhujiang HospitalSouthern Medical UniversityGuangzhou 510280China Second Department of Hepatobiliary Surgery Zhujiang HospitalSouthern Medical UniversityGuangzhou 510280China Nursing Department Nanfang HospitalSouthern Medical UniversityGuangzhou 510515China Department of Urology Minimally Invasive Surgery Centerthe First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical UniversityGuangzhou 510120China Department of Urology Guangzhou Women and Children’s Medical CenterGuangzhou Medical UniversityGuangzhou 510623China Department of Urology Peking University Shenzhen HospitalShenzhen 518036China

Owing to incurable castration-resistant prostate cancer(CRPC)ultimately developing after treating with androgen deprivation therapy(ADT),it is vital to devise new therapeutic strategies to treat *** that target programmed cell death protein 1(PD-1)and programmed death ligand-1(PD-L1)have been approved for human cancers with clinical ***,many patients,especially prostate cancer,fail to respond to anti-PD-1/PD-L1 treatment,so it is an urgent need to seek a support strategy for improving the traditional PD-1/PD-L1 targeting *** the present study,analyzing the data from our prostate cancer tissue microarray,we found that PD-L1 expression was positively correlated with the expression of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L(Hn RNP L).Hence,we further investigated the potential role of Hn RNP L on the PD-L1 expression,the sensitivity of cancer cells to T-cell killing and the synergistic effect with anti-PD-1 therapy in ***,Hn RNP L knockdown effectively decreased PD-L1 expression and recovered the sensitivity of cancer cells to T-cell killing in vitro and in vivo,on the contrary,Hn RNP L overexpression led to the opposite effect in CRPC *** addition,consistent with the previous study,we revealed that ferroptosis played a critical role in T-cell-induced cancer cell death,and Hn RNP L promoted the cancer immune escape partly through targeting YY1/PD-L1 axis and inhibiting ferroptosis in CRPC ***,Hn RNP L knockdown enhanced antitumor immunity by recruiting infiltrating CD8^(+)T cells and synergized with anti-PD-1 therapy in CRPC *** study provided biological evidence that Hn RNP L knockdown might be a novel therapeutic agent in PD-L1/PD-1 blockade strategy that enhanced anti-tumor immune response in CRPC.

关键词： HnRNP L PD-L1 YY1 Ferroptosis Immune escape Immune checkpoint blockade Anti-PD-1 therapy Castration-resistant prostate cancer

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通贡和好:明朝重建西域秩序的路径选择

中国边疆史地研究 2022年第4期32卷 44-48,49-56,214页

作者：田澍杨涛维西北师范大学历史文化学院兰州市安宁区730070 中国历史研究院田澍工作室

持续半个多世纪的“哈密危机”随着土鲁番的迅速崛起和成化以后明朝的应对失措而愈演愈烈。在钦定“大礼议”之后,明世宗起用熟悉西北边疆事务的王琼,令其全权处理“哈密危机”。王琼认为采取“通贡和好”的措施,重建西域秩序,方能解除... 详细信息

持续半个多世纪的“哈密危机”随着土鲁番的迅速崛起和成化以后明朝的应对失措而愈演愈烈。在钦定“大礼议”之后,明世宗起用熟悉西北边疆事务的王琼,令其全权处理“哈密危机”。王琼认为采取“通贡和好”的措施,重建西域秩序,方能解除来自西域的军事威胁,确保西北边疆的安全与稳定。在明世宗的全力支持下,王琼的主张得以实现,“通贡和好”成为明朝中央与西域地方各政治体交往的主旋律,西北边疆治理从此进入新的时代。

关键词：土鲁番 “哈密危机” 闭关绝贡通贡和好

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木质素荧光研究进展

化工进展 2022年第5期41卷 2672-2685页

作者：申琪薛雨源杨涛伟张妍李胜任太原理工大学化学化工学院山西太原030024

木质素是植物细胞壁荧光的主要来源,是一种天然高分子荧光材料,但木质素的荧光机理和调控机制不明确,制约了其荧光特性的高值利用。本文从木质素荧光团化学结构的筛选和木质素荧光团间聚集耦合态的研究两方面出发,系统地综述了木质素荧... 详细信息

木质素是植物细胞壁荧光的主要来源,是一种天然高分子荧光材料,但木质素的荧光机理和调控机制不明确,制约了其荧光特性的高值利用。本文从木质素荧光团化学结构的筛选和木质素荧光团间聚集耦合态的研究两方面出发,系统地综述了木质素荧光的研究现状,并分别对其研究思路和存在的科学问题进行了总结和凝练。分析表明,首先,由于木质素的自吸收效应和荧光淬灭剂的存在,仅从荧光强度和发射波长两方面筛选与真实木质素荧光相近的模型物作为其荧光团的结论存在一定局限性;其次,木质素荧光团间存在相互作用,单独分析木质素荧光团的化学结构意义有限,木质素真实发光基团是这些荧光团间的聚集耦合态;再次,在木质素微结构聚集行为研究和聚集诱导发光理论的基础上,已从宏观层面明确了木质素胶团间和胶团内两种基本聚集行为对其荧光的影响规律和作用机制,今后的研究应完善木质素聚集荧光行为的关联模型,并从微观分子层面深入揭示木质素荧光团间的耦合机制;最后,木质素荧光并非是一个单纯的光物理性质研究,更是一个由木质素化学结构解析、木质素微结构调控、木质素激发态能量转移等多方向交叉形成的综合性课题,揭示木质素荧光机制仍然是一个具有挑战性的工作,进而会对木质素其他方向的研究起到促进作用。

关键词：生物质木质素荧光纳米结构聚集(作用) 功能材料

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氧甲基转移酶编码基因ploy(A)加尾促进粘质沙雷氏菌合成灵菌红素能力研究

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食品与发酵工业 2021年第9期47卷 49-56页

作者：孙杨王丽君杨套伟付维来易敢峰饶志明工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 大北农水产科技集团福建诏安363500

粘质沙雷氏菌能在30℃高效合成灵菌红素,但在37℃甚至更高温度则丧失合成能力。研究表明,在37℃甚至更高温度下,粘质沙雷氏菌中灵菌红素合成关键酶氧甲基转移酶(O-methyltransferase,PigF)的表达量显著下降。因此,通过人工在pigF基因3... 详细信息

粘质沙雷氏菌能在30℃高效合成灵菌红素,但在37℃甚至更高温度则丧失合成能力。研究表明,在37℃甚至更高温度下,粘质沙雷氏菌中灵菌红素合成关键酶氧甲基转移酶(O-methyltransferase,PigF)的表达量显著下降。因此,通过人工在pigF基因3′端添加6条不同的poly(A/T)尾来提高pigF基因mRNA稳定性,并观察其对粘质沙雷氏菌中PigF表达量及灵菌红素合成的影响。结果发现,添加“AAAAAA”可以保护mRNA免受降解,从而使得pigF转录水平提高71%。其次,添加“AAAAAA”后,PigF比酶活力提高了41.8%。最后通过摇瓶发酵,实验结果表明,与30℃培养的原始菌株相比,工程改造的JNB5-1/pigF FP菌株的灵菌红素产量达到6.21 g/L,提高了15.9%。该研究表明,通过引入poly(A/T)尾提高了PigF的表达量,进而提高了粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的能力。

关键词：粘质沙雷氏菌灵菌红素氧甲基转移酶(PigF) 温度

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谷氨酰胺酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

食品与生物技术学报 2019年第10期38卷 60-66页

作者：张美丹饶志明张显杨套伟徐美娟江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒pMA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反... 详细信息

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒pMA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反应最适pH为7.5,反应最适温度为55℃,La^3+、Zn^2+、Fe^3+和Al^3+对谷氨酰胺酶活力具有一定的抑制作用,在NaCl浓度为15%~17.5%的条件下,该酶酶活力可以保留50%以上。在5 L罐中,通过分批补料发酵,其最高酶活力产量为215.06 U/mL。

关键词：枯草芽孢杆菌谷氨酰胺酶酶学性质

基于蛋白表面电荷工程分子改造枯草芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶最适催化pH

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应用与环境生物学报 2023年第1期29卷 7-14页

作者：武文慧刘菲王雅玲杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)催化L-谷氨酸可逆氧化脱氨生成α-酮戊二酸,为研究其催化特性,在大肠杆菌中克隆表达了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(BsGDH).酶学特征表明,BsGDH具有氧化和还原双向酶活性且最适催化温度分... 详细信息

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)催化L-谷氨酸可逆氧化脱氨生成α-酮戊二酸,为研究其催化特性,在大肠杆菌中克隆表达了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(BsGDH).酶学特征表明,BsGDH具有氧化和还原双向酶活性且最适催化温度分别为60℃和65℃,最适催化pH均为弱碱性(分别为pH 8.0和pH 7.5),但在弱碱环境下(pH 7.0-8.0)该酶稳定性较差.为提高BsGDH在催化合成α-酮戊二酸应用中的经济性,基于蛋白表面电荷工程,对该酶进行分子改造,以期将其催化最适pH调至其稳定性较高的中性环境.首先利用ROSETTA软件选择7个突变候选位点,结果发现突变体N16D和K218D催化谷氨酸合成α-酮戊二酸的最适pH由8.0下调至7.0,同时在pH 7.0条件下酶活较野生型分别提高2.9倍和5.4倍,且逆反应还原方向酶活降低.另外,突变体N16D和K218D热稳定性都得到显著改善,50℃下放置3 h后,突变体N16D可以保持54%左右的酶活,K218D保持40%左右的酶活,而野生型酶活此时完全丧失.本研究成功将BsGDH最适催化pH范围下调至其稳定性良好的pH范围.(图10表3参23)

关键词：谷氨酸脱氢酶酶学性质最适pH 表面电荷工程定点突变