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定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

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食品与生物技术学报 2015年第11期34卷 1128-1134页

作者：张显龙水清饶志明杨套伟徐美娟江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变... 详细信息

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择5个点进行突变,构建6个突变菌株。酶活测定结果表明,突变体酶S299N_(ansz)和P348A_(ansz)的酶活较Bs AII分别提高28%和32%。其中P348A_(ansz)的热稳定性和p H稳定性较Bs AII均有明显提高。本研究表明,第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响,对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础,并提高了该酶的工业应用潜力。

关键词： L-天冬酰胺酶定点突变热稳定性 pH稳定性

通过融合双亲短肽改善L-天冬酰胺酶酶学特性

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食品与生物技术学报 2015年第11期34卷 1178-1184页

作者：杨套伟饶志明贾明媚张显徐美娟江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

L-天冬酰胺酶可以将L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸与氨,主要应用在医药与食品行业。作者尝试在L-天冬酰胺酶N-末端融合不同的自组双亲短肽,改善该酶的酶学特性。首先,利用分子克隆技术将6条分别具有不同特征的短肽与L-天冬酰胺酶的N-端融... 详细信息

L-天冬酰胺酶可以将L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸与氨,主要应用在医药与食品行业。作者尝试在L-天冬酰胺酶N-末端融合不同的自组双亲短肽,改善该酶的酶学特性。首先,利用分子克隆技术将6条分别具有不同特征的短肽与L-天冬酰胺酶的N-端融合,并在Escherichia coli BL21中进行表达,最后,利用Ni^(2+)-NTA纯化获得纯的重组L-天冬酰胺酶酶液。结果表明,融合SAP4对L-天冬酰氨酶(ans Z酶)动力学特征影响较大,融合蛋白SAP4-ans Z的比活力较融合前提高约30%,其中重组蛋白K_m值较原始酶下降了7.5%,而V_(max)值得提升了10%,说明融合SAP4可以改善ans Z酶对L-天冬酰胺的水解效率。

关键词： L-天冬酰胺酶双亲短肽融合酶学特征

理性设计定点突变提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶热稳定性

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食品与生物技术学报 2017年第9期36卷 906-911页

作者：郭静饶志明杨套伟满在伟张显徐美娟李星江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对***酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(Δ... 详细信息

利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对***酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性,利用定点突变构建突变体,并且在大肠杆菌中对野生型酪氨酸酶及突变体进行表达,最终获得了两个热稳定性提高的突变体R95Y、G123W。在此基础上进行复合突变,获得了一个热稳定性显著提高的突变体R95Y/G123W。该突变体在60℃的半衰期提高了2.43倍,最适反应温度由45℃提高到50℃,本研究所用的基于蛋白质结构的理性设计提高稳定性的策略也可以应用于其他工业酶类,显示了良好的应用前景。

关键词：酪氨酸酶氢键定点突变热稳定性理性设计 POPMuSiC

豆酱源枯草芽孢杆菌S1-2产细菌素分离鉴定及其稳定性研究

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食品工业科技 2024年第8期45卷 158-164页

作者：张淘崴乌日娜纪帅奇娄梦雪马颖武俊瑞沈阳农业大学食品学院辽宁沈阳110866 辽宁省食品发酵技术工程研究中心辽宁沈阳110161 沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室辽宁沈阳110866

本研究首先从东北传统豆酱中分离筛选出一株具有良好抑菌作用的菌株,结合16S rDNA与持家基因gyrA测序分析等方法对菌株鉴定。其次,利用乙酸乙酯萃取法对其所产细菌素进行粗提,使用葡聚糖凝胶Sephadex-G50和高效液相色谱(HPLC)技术进一... 详细信息

本研究首先从东北传统豆酱中分离筛选出一株具有良好抑菌作用的菌株,结合16S rDNA与持家基因gyrA测序分析等方法对菌株鉴定。其次,利用乙酸乙酯萃取法对其所产细菌素进行粗提,使用葡聚糖凝胶Sephadex-G50和高效液相色谱(HPLC)技术进一步纯化,结合SDS-PAGE和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术进行鉴定。最后通过最小浓度实验与生长抑制曲线分析了细菌素对金黄色葡萄球菌的抑制效果,并探究了细菌素对热、酸碱和蛋白酶的稳定性。结果表明,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株S1-2对金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌抑菌效果最好,该菌株产生的细菌素经分离纯化鉴定为subtilosin A,分子量约为3 kDa,对金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌有明显的抑制效果,对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为0.625 mg/mL。该细菌素在20~80℃抑菌活性稳定,且在100~120℃仍表现出抑菌活性;对酸碱耐受性较高,经过pH为1、10的强酸强碱处理后仍表现出抑菌活性,在pH6.0~8.0的范围内表现出最高的抑菌活性;能够被蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶水解。综上,枯草芽孢杆菌S1-2与其产生的细菌素subtilosin A在食品生物防腐中具有较强的研究和应用潜力。

关键词：枯草芽孢杆菌细菌素分离纯化抑菌

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一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

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应用与环境生物学报 2015年第3期21卷 435-440页

作者：程毅鹏饶志明杨套伟满在伟徐美娟张显江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌,为了进一步提高核黄素的产量,需要对该菌株进行进一步的基因工程改造.本研究首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因sat克隆到pMA5质粒上,构建具... 详细信息

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1是课题组前期通过基因工程改造得到的一株核黄素高产菌,为了进一步提高核黄素的产量,需要对该菌株进行进一步的基因工程改造.本研究首先将编码的链丝菌素乙酰基转移酶基因sat克隆到pMA5质粒上,构建具有诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)抗性的重组质粒pMA5-sat,实验证实该重组质粒能够用于*** RF1的抗性筛选.随后将核黄素合成相关的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf克隆到重组质粒pMA5-sat上,获得重组质粒pMA5-sat-zwf,并成功构建重组菌*** RF1/p MA5-sat-zwf.结果显示,重组菌胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力比原始菌提高了近50倍,说明葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在重组菌中成功过量表达;根据发酵特性分析,重组菌*** RF1/pMA5-sat-zwf最终核黄素产量达到12.01 g/L,比原始菌*** RF1提高了30.3%.综上,本研究构建的新型抗性质粒能够成功运用于核黄素生产菌枯草芽孢杆菌的基因工程改造.

关键词：枯草芽孢杆菌抗性质粒核黄素葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

高产抗菌脂肽芽孢杆菌的分离鉴定筛选及发酵工艺优化

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食品工业科技 2024年第4期45卷 101-108页

作者：纪帅奇乌日娜张淘崴娄梦雪贺凯茹张妍武俊瑞沈阳农业大学食品学院辽宁沈阳110866 辽宁省食品发酵技术工程研究中心辽宁沈阳110866 沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室辽宁沈阳110866

为了筛选出高产抗菌脂肽的芽孢杆菌并确定其最佳发酵工艺条件,研究从传统发酵豆酱中分离和鉴定产抗菌脂肽芽孢杆菌菌株,通过正交试验研究了发酵接种量、发酵填液量、发酵时间、发酵温度等发酵条件对芽孢杆菌脂肽产量的影响。结果表明,从... 详细信息

为了筛选出高产抗菌脂肽的芽孢杆菌并确定其最佳发酵工艺条件,研究从传统发酵豆酱中分离和鉴定产抗菌脂肽芽孢杆菌菌株,通过正交试验研究了发酵接种量、发酵填液量、发酵时间、发酵温度等发酵条件对芽孢杆菌脂肽产量的影响。结果表明,从9份东北传统发酵豆酱中分离筛选得到27株芽孢杆菌,经16S rDNA鉴定,其中6株芽孢杆菌具有合成脂肽的基因sfp、fenB和ituA。通过单位菌体脂肽产量和抑菌效果测定发现,贝莱斯芽孢杆菌SN-20和解淀粉芽孢杆菌SN-46表现优异,单位菌体脂肽产量达106和72 mg,且对革兰氏阳性和阴性指示菌均有较强的抑菌效果。正交试验发现贝莱斯芽孢杆菌SN-20最佳发酵工艺为:接种量3%,发酵填液量20%,发酵时间36 h,发酵温度32℃;枯草芽孢杆菌SN-46最佳发酵工艺为:接种量2%,发酵填液量40%,发酵时间24 h,发酵温度32℃。在此条件下发酵的两株芽孢杆菌单位菌体脂肽产量优化前为106.11和76.23 mg/g,优化后分别提高了21.85%和23.84%。研究结果有效地增加了芽孢杆菌抗菌脂肽的产量。

关键词：抗菌脂肽芽孢杆菌筛选鉴定发酵工艺优化

枯草芽孢杆菌SNBS-3全基因组测序及其抑菌物质预测分析

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食品科学 2024年第2期45卷 57-63页

作者：纪帅奇乌日娜张淘崴娄梦雪丁瑞雪马颖武俊瑞沈阳农业大学食品学院辽宁沈阳110866 辽宁省食品发酵技术工程研究中心辽宁沈阳110866 沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室辽宁沈阳110866

为了详细解析枯草芽孢杆菌SNBS-3的基因组特征,本研究在前期研究基础上,采用Illumina二代测序技术和第三代高通量Pacbio测序平台,对从传统豆酱中筛选得到的枯草芽孢杆菌SNBS-3进行全基因组测序,获得菌株基因组特征信息、基因功能注释及... 详细信息

为了详细解析枯草芽孢杆菌SNBS-3的基因组特征,本研究在前期研究基础上,采用Illumina二代测序技术和第三代高通量Pacbio测序平台,对从传统豆酱中筛选得到的枯草芽孢杆菌SNBS-3进行全基因组测序,获得菌株基因组特征信息、基因功能注释及分类、系统发育进化和次级代谢产物等关键信息。结果表明:SNBS-3的基因组为一条环状闭合DNA,大小为4076387 bp,共有4000个蛋白质编码基因,在直系同源集、基因本体论、京都基因与基因组百科全书、碳水化合物活性酶、抗生素耐药性数据库和致病毒力因子数据库分别注释到3209、2824、2560、147、12个和4个功能基因。应用在线软件AntiSMASH和Bagel4发现其除具有合成Surfactin、Mycosubtilin、Plipastatin、Bacilysin和Bacillaene等多种抑菌物质的相关基因外,还具有一条完整的细菌素Subtilosin A合成基因簇,结合抑菌实验和蛋白酶K实验结果推测枯草芽孢杆菌SNBS-3具有合成细菌素SubtilosinA的能力。综上,枯草芽孢杆菌SNBS-3全基因组测序结果表明其本身可产生多种抑菌物质,是1株具有生防潜力的微生物,相关分析结果可为包括细菌素SubtilosinA在内的多种抑菌物质的进一步开发应用提供理论基础。

关键词：枯草芽孢杆菌全基因组细菌素合成基因簇

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重组酿酒酵母生物合成菜油甾醇

化工学报 2021年第8期72卷 4314-4324页

作者：周武林高惠芳吴玉玲张显徐美娟杨套伟邵明龙饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

菜油甾醇作为甾体药物(孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等)的重要合成前体已受到国内外研究学者的广泛关注。首先通过生物信息学分析,筛选了10种不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将酿酒酵母(Saccharomyces ... 详细信息

菜油甾醇作为甾体药物(孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等)的重要合成前体已受到国内外研究学者的广泛关注。首先通过生物信息学分析,筛选了10种不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)内源的ERG5基因替换成不同来源的DHCR7基因,构建了菜油甾醇合成菌株。结果发现整合来源于Pangasianodon hypophthalmus DHCR7的菌株Zw507表现出最高的菜油甾醇的产量216.93 mg/L。进一步筛选了10种酵母内源启动强度较强的启动子来与PhDHCR7基因进行组合,结果显示以TEF1p为启动子时菜油甾醇的产量最高可达253.35 mg/L。为了进一步提高菜油甾醇产量,增加了DHCR7表达盒在酵母基因组上的拷贝数。当拷贝数为3个时,菜油甾醇的产量达到最高302.27 mg/L。最终,通过5 L发酵罐进行补料分批发酵,实现了916.88 mg/L菜油甾醇产量。该菌株可作为后续甾体药物生物合成的优良底盘细胞。

关键词： 7-脱氢胆固醇还原酶酿酒酵母菜油甾醇合成生物学补料分批发酵

基于多酶级联协调表达策略高效催化合成(S)-2-羟基丁酸

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生物工程学报 2021年第12期37卷 4231-4242页

作者：田灵芝周俊平杨套伟张显邵明龙徐美娟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

2-羟基丁酸(2-hydroxybutyric acid,2-HBA)是合成生物可降解材料和各种药物的重要中间体,化学法合成的外消旋2-HBA需要去消旋才能获得光学纯对映异构体,应用于工业。文中通过在大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)中共表达苏氨酸脱氨酶(T... 详细信息

2-羟基丁酸(2-hydroxybutyric acid,2-HBA)是合成生物可降解材料和各种药物的重要中间体,化学法合成的外消旋2-HBA需要去消旋才能获得光学纯对映异构体,应用于工业。文中通过在大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)中共表达苏氨酸脱氨酶(Threoninedeaminase,TD)、L-乳酸脱氢酶(L-lactatedehydrogenase,LDH)和甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FDH),构建(S)-2-HBA的合成途径及其辅因子NADH的循环系统,实现了基于三酶级联反应催化底物L-苏氨酸合成(S)-2-HBA。为了解决多酶级联催化反应中中间产物2-酮丁酸的生成速率和消耗率不匹配的问题,文中通过启动子工程策略来调控TD和FDH的表达水平,获得了多酶催化速率平衡的重组大肠杆菌P21285FDH-T7V7827。在5 L发酵罐水平,全细胞催化反应16 h,(S)-2-HBA的最高产量为143g/L,摩尔转化率为97%,为迄今报道的最高产量的1.83倍,使其具有较强的工业化应用潜力。此外,结果表明,在单细胞中构建可调节的多酶协调表达系统对生物催化制备羟基酸类化合物具有重要意义。

关键词：级联生物催化 (S)-2-羟基丁酸多酶协调表达系统 NADH循环启动子工程