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代谢工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻

基因组学与应用生物学 2017年第12期36卷 5159-5166页

作者：李欣张显杨套伟徐美娟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要代谢产物,它作为一种食用香精,广泛应用于食品、烟草、化妆品、清洁剂、酒类等行业。本研究首先在不产芽孢的枯草芽孢杆菌(BSD1,阻断了芽孢的合成途径)中敲除了2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因bdh A、乳酸... 详细信息

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要代谢产物,它作为一种食用香精,广泛应用于食品、烟草、化妆品、清洁剂、酒类等行业。本研究首先在不产芽孢的枯草芽孢杆菌(BSD1,阻断了芽孢的合成途径)中敲除了2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因bdh A、乳酸脱氢酶(LDH)的编码基因ldh和乙酸激酶的编码基因(ACK)ack A,随后克隆了来自菌株***168的α-乙酰乳酸合成酶(ALS)和α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因als S和als D,并将其在上述敲除菌中过量表达,结果表明阻断副产物合成途径和加强乙偶姻合成途径关键酶的表达,会显著提高乙偶姻的产量,最终乙偶姻产量达到38.08 g/L,产率为0.45 g·L^(-1)·h^(-1),产率提高了约87.5%。

关键词：乙偶姻枯草芽孢杆菌 2,3-丁二醇脱氢酶乳酸脱氢酶 α-乙酰乳酸合成酶

谷氨酸棒杆菌耐受胁迫机制及工业鲁棒性合成生物学研究进展

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生物工程学报 2021年第3期37卷 831-845页

作者：徐美娟上官春雨陈鑫张显杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum作为一般被认为具有生物安全性的一种模式工业微生物,不仅在发酵工业中成功用于大规模生产氨基酸,而且具有合成多种新型化学品的潜力。谷氨酸棒杆菌菌株在生产化合物时,经常会受到各种逆境条件... 详细信息

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum作为一般被认为具有生物安全性的一种模式工业微生物,不仅在发酵工业中成功用于大规模生产氨基酸,而且具有合成多种新型化学品的潜力。谷氨酸棒杆菌菌株在生产化合物时,经常会受到各种逆境条件的胁迫,从而降低细胞活力和生产性能。合成生物学的发展为提高谷氨酸棒杆菌的鲁棒性提供了新的技术手段。本文总结了谷氨酸棒杆菌应对发酵过程中各种胁迫的耐受机制。同时,重点介绍提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性和耐受性的合成生物学新策略,包括挖掘新的抗逆元件、改造转录调控因子、利用适应性进化策略挖掘抗逆功能模块等。最后,从生物传感器、转录调控因子的筛选和设计、多种调控元件利用等方面对提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性进行了展望。

关键词：谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性耐受机制合成生物学

亮氨酸脱氢酶偶联NADH再生体系合成L-2-氨基丁酸

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生物工程学报 2020年第5期36卷 992-1001页

作者：张利坤肖延铭杨卫华华超王云李敬亚杨套伟长兴制药股份有限公司工业生物催化与转化浙江省工程研究中心浙江长兴313100 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体... 详细信息

文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体系,以L-苏氨酸为起始原料,利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)与LDH-FDH或LDH-ADH一锅法合成L-2-氨基丁酸,并对LDH-FDH工艺和LDH-ADH工艺进行对比优化。LDH-FDH工艺的最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃,通过加入50 g/L甲酸铵、0.3 g/L NAD^+、10%LDH-FDH粗酶液(V/V)和7500 U/L的L-TD酶液,对L-苏氨酸进行分批补加,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,反应28 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为161.8 g/L,产率97%。LDH-ADH工艺的最适pH为8.0,最适反应温度为35℃,通过加入0.3 g/L NAD^+、10%LDH-ADH粗酶液(V/V)及7500 U/L的L-TD酶液,分批补加L-苏氨酸及1.2倍摩尔量异丙醇,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,且每生成约40 g/L的L-2-氨基丁酸,抽真空去除丙酮,反应24 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为119.6 g/L,产率98%。文中所采用的工艺及结果可为L-2-氨基丁酸的工业化提供一定的参考依据。

关键词：共表达 L-2-氨基丁酸生物催化 NADH再生

过量表达枯草芽孢杆菌乙偶姻还原酶提高2,3-丁二醇产量

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食品与生物技术学报 2016年第3期35卷 252-257页

作者：李秀鹏杨套伟徐美娟张显饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产的菌株,但是在2,3-丁二醇(2,3-BD)的发酵过程中,会积累较多的副产物乙偶姻(AC)。乙偶姻还原酶是催化AC合成2,3-BD的关键酶。为了提高2,3-BD合成效率,首先将乙偶姻还原酶基因acr克隆到**... 详细信息

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产的菌株,但是在2,3-丁二醇(2,3-BD)的发酵过程中,会积累较多的副产物乙偶姻(AC)。乙偶姻还原酶是催化AC合成2,3-BD的关键酶。为了提高2,3-BD合成效率,首先将乙偶姻还原酶基因acr克隆到*** 168,构建了重组菌*** 168/p MA5-acr。对重组菌进行摇瓶发酵实验,结果表明,相比出发菌,重组菌的2,3-BD产量和转化率分别提高28.62%和22.87%,主要副产物AC积累量下降了20.01%。同时,分支路径的副产物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸,也有不同程度的降低。

关键词：乙偶姻还原酶 2,3-丁二醇乙偶姻枯草芽孢杆菌

基于IPSO-BP神经网络的导线舞动预警方法

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电力科学与技术学报 2024年第2期39卷 152-158页

作者：杨春侠曹倩于增豪朱陶炜李春林王文长沙理工大学土木工程学院湖南长沙410114 长沙理工大学电气与信息工程学院湖南长沙410114

为确保输电线路在易舞气象条件下的正常运维,根据线路舞动与气象条件之间的复杂映射关系,采用改进粒子群算法(improved particle swarm optimization,IPSO)对BP神经网络进行优化,提出一种基于改进粒子群算法优化BP(IPSO-BP)神经网络的... 详细信息

为确保输电线路在易舞气象条件下的正常运维,根据线路舞动与气象条件之间的复杂映射关系,采用改进粒子群算法(improved particle swarm optimization,IPSO)对BP神经网络进行优化,提出一种基于改进粒子群算法优化BP(IPSO-BP)神经网络的导线舞动预测方法。利用文本挖掘技术分析舞动影响因素,确定以档距、覆冰厚度、温度、风速、风向、相对湿度及风向与线路走向夹角为特征输入的IPSO-BP神经网络模型,通过舞动历史数据训练模型以达到预测的功能。对比IPSO-BP神经网络模型与其他算法模型的精度和稳定性,结果表明该方法具有一定的优越性。最后采用该方法预测河南谢庄地区的导线舞动,验证该方法的准确性和实用性。

关键词：输电线路舞动预警粒子群算法 BP神经网络

构建辅酶自循环系统全细胞催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇

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应用与环境生物学报 2020年第1期26卷 152-159页

作者：赵有玺刘松张显徐美娟杨套伟饶志明北京联合大学生物化学工程学院北京100023 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

S-2-氨基-1-苯基乙醇是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒剂等多种具有生理活性药物的合成.目前其合成主要通过化学手段,虽然工艺成熟,但反应条件剧烈,且会生成许多副产物.基于新鉴定的铜绿假单胞菌来源的ω-转氨酶,设... 详细信息

S-2-氨基-1-苯基乙醇是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒剂等多种具有生理活性药物的合成.目前其合成主要通过化学手段,虽然工艺成熟,但反应条件剧烈,且会生成许多副产物.基于新鉴定的铜绿假单胞菌来源的ω-转氨酶,设计了一个结合新金色分枝杆菌来源的醇脱氢酶的级联酶催化体系,从而将较为廉价的苯基-1,2-乙二醇一步催化合成具有高附加值的S-2-氨基-1-苯基乙醇.为了解决级联催化过程中辅酶再生和氨基供体再生问题,在该级联体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶,构建一个封闭的氧化还原自循环系统,从而实现辅酶(NADP+)和辅底物(L-Glu)的同时再生.最后将这3个酶串联表达在pETDuet和pACYCDuet质粒上,并转入大肠杆菌中,获得了重组菌Escherichia coli BL21(MPG).通过重组菌全细胞转化,结果显示在100 mL、pH 8.0的NH4Cl溶液中,37℃条件下反应10 h后,OD600=30的该重组菌可一步催化50 mmol/L苯基-1,2-乙二醇生成光学纯的S-2-氨基-1-苯基乙醇,转化率达到99.6%,产物的ee值>99%.本研究提供了一种高效经济催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇的方法,不需要受到辅因子供应不足的限制以及副产物的积累的影响.

关键词： S-2-氨基-1-苯基乙醇苯基-1,2-乙二醇 ω-转氨酶辅酶自循环系统全细胞生物催化

一种碱性γ-谷氨酰转肽酶在Bacillus subtilis 168中的分泌表达与酶学性质分析

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食品与生物技术学报 2017年第2期36卷 149-155页

作者： Bernard Gitura Kimani 杨套伟饶志明张显徐美娟和斐江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

将γ-谷氨酰转肽酶(GGT)在Bacillus subtilis 168同源过量表达,发现该酶能够自动分泌到细胞外,且重组菌酶活比原始菌提高了3 568倍。通过SDS-PAGE分析发酵液上清液发现,该γ-谷氨酰转肽酶是由一个相对分子质量为42 000的大亚基和一个22 ... 详细信息

将γ-谷氨酰转肽酶(GGT)在Bacillus subtilis 168同源过量表达,发现该酶能够自动分泌到细胞外,且重组菌酶活比原始菌提高了3 568倍。通过SDS-PAGE分析发酵液上清液发现,该γ-谷氨酰转肽酶是由一个相对分子质量为42 000的大亚基和一个22 000的小亚基组成。通过酶学性质分析发现,该γ-谷氨酰转肽酶是一个耐碱性的酶,最适反应pH为10;同时该酶具有良好的耐热性,最适反应温度达到50℃;另外,加入5.0 mmol/L的Mg^(2+)、Ca^(2+)、K^+、La^(3+)、Li^+和NH_4^+对GGT转肽活力具有明显的促进作用,其中添加的NH_4^+对GGT活力促进作用最为显著,GGT活力提高45%以上,而Cu^(2+)和Zn^(2+)则对其具有抑制作用。

关键词： γ-谷氨酰转肽酶分泌表达酶学特征 Bacillus subtilis 168

天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化

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生物工程学报 2019年第7期35卷 1348-1358页

作者：吴傲张显徐美娟杨套伟李华钟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因(ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行了异源表达,通过Ni-NTA亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经SDS-PAGE测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性... 详细信息

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因(ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行了异源表达,通过Ni-NTA亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经SDS-PAGE测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性质发现该酶最适温度35℃;最适pH7.0,对酸性条件比较敏感。通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变。突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14%和10%。利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5L罐发酵,结果表明:在麦芽糖浓度300g/L、初始反应温度和pH分别为35℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3%,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98g/L。

关键词：海藻糖合酶克隆表达定点突变全细胞转化

点突变提高甲酸脱氢酶(CbFDH)的酶活和催化效率

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食品与生物技术学报 2019年第3期38卷 1-9页

作者：郑俊贤王子渊杨套伟张显徐美娟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

甲酸脱氢酶(FDH)是工业上常用的辅酶NADH再生酶,而天然的FDH主要缺陷是酶活和催化效率低。作者通过序列比对7种不同来源的FDH,发现其中来源于Candida boidinii的FDH的第93位氨基酸为缬氨酸(V),而其余6种来源均为异亮氨酸(I)。进一步根... 详细信息

甲酸脱氢酶(FDH)是工业上常用的辅酶NADH再生酶,而天然的FDH主要缺陷是酶活和催化效率低。作者通过序列比对7种不同来源的FDH,发现其中来源于Candida boidinii的FDH的第93位氨基酸为缬氨酸(V),而其余6种来源均为异亮氨酸(I)。进一步根据疏水性大小,构建4个突变体酶V93L、V93I、V93A和V93G。酶学性质研究表明,除了V93L外,突变体酶的酶活随着第93位氨基酸残基的疏水性增强而提高。其中,V93I的比酶活提高22.6%、催化效率(NAD+)提高了133%。利用V93I偶联L-亮氨酸脱氢酶用于不对称还原2-氧代戊酸合成L-正缬氨酸,结果表明V93I能够提高2-氧代戊酸的转化效率。

关键词：甲酸脱氢酶疏水性定点突变催化效率 L-正缬氨酸