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Increasingβ-hexosaminidase A activity using genetically modified mesenchymal stem cells

Neural Regeneration Research 2024年第1期19卷 212-219页

作者： Alisa A.shaimardanova Daria s.Chulpanova Valeriya V.solovуeva shaza s.issa Aysilu I.Mullagulova Angelina A.Titova Yana O.Mukhamedshina Anna V.Timofeeva Alexander M.Aimaletdinov Islam R.Nigmetzyanov Albert A.Rizvanov Institute of Fundamental Medicine and Biology Kazan Federal UniversityKazanRussia Department of Histology Cytology and EmbryologyKazan State Medical UniversityKazanRussia

GM2 gangliosidoses are a group of autosomal-recessive lysosomal storage disorde *** diseases result from a deficiency of lysosomal enzymeβ-hexosaminidase A(HexA),which is responsible for GM2 ganglioside *** deficiency causes the accumulation of GM2-gangliosides mainly in the nervous system cells,leading to severe progressive neurodegeneration and *** date,there is no treatment for these ***-mediated gene therapy is considered a promising treatment for GM2 *** study aimed to evaluate the ability of genetically modified mesenchymal stem cells(MsCs-HEXA-HEXB)to restore HexA deficiency in Tay-sachs disease patient cells,as well as to analyze the functionality and biodistribution of MsCs in *** effectiveness of HexA deficiency cross-correction was shown in mutant MsCs upon intera ction with *** results also showed that the MsCs-HEXA-HEXB express the functionally active HexA enzyme,detectable in vivo,and intravenous injection of the cells does not cause an immune response in *** data suggest that genetically modified mesenchymal stem cells have the potentials to treat GM2 gangliosidoses.

关键词： adeno-associated viral vectors cell therapy cell-mediated gene therapy gene therapy GM2 gangliosidosis sandhoff disease Tay-sachs disease β-hexosaminidase

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用体细胞核移植构建的猪早期胚胎冷冻保存研究

用体细胞核移植构建的猪早期胚胎冷冻保存研究

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作者： shaza MOHAMMED YOUsIF 南京农业大学

学位级别：硕士

本研究设计2部分实验用以研究比较猪早期胚胎（2-细胞到8-细胞胚胎）的冷冻保存效果。分别以不同的玻璃化液为冷冻液,采用同样的方法进行胚胎的玻璃化冷冻和解冻。第一个实验的主要内容是为构建体细胞克隆胚胎准备成熟的成熟的受体... 详细信息

本研究设计2部分实验用以研究比较猪早期胚胎（2-细胞到8-细胞胚胎）的冷冻保存效果。分别以不同的玻璃化液为冷冻液,采用同样的方法进行胚胎的玻璃化冷冻和解冻。第一个实验的主要内容是为构建体细胞克隆胚胎准备成熟的成熟的受体卵母细胞,用于获得克隆胚胎之后的玻璃化冷冻;同时也比较了体外培养时间对卵母细胞成熟的影响。卵母细胞用含10%新生牛血清（NCs）.10 IU/ml孕马血清促性腺激素（PMsG）,10 IU/ml人绒毛膜促性腺激素（hCG）,1μg/ml 17β-E2,10%猪卵泡液（pFF）,69μg/ml L-半胱氨酸的TCM199溶液体外培养44-48 h。实验一的另一部分内容分别以猪卵丘细胞和小鼠卵丘细胞作为核供体细胞,构建克隆胚胎,比较2种供体细胞对克隆胚胎体外发育影响。结果表明,两组2-细胞发育率分别为75.5%和73.6%,8-细胞发育率分别为56.8%和28.1%。这些结果同时证明,猪受体卵母细胞内的一些因子也可对外源性的体细胞进行一定程度的重编程,并启动其分裂。另外,小鼠-猪种间核移植胚胎的发育率没有显著差异（P＞0.05）;但在本实验条件下,我们的体细胞核移植研究发现猪体细胞核移植和小鼠-猪种间核移植胚胎在体外培养至8-ce11阶段均停止了发育。本研究第二个实验的目的是研究3种不同的玻璃化冷冻液对猪早期胚胎（2-、4-和8-细胞期）冷冻保存后存活率的影响。Vs-1:Es40（40%乙二醇+0.5M蔗糖）;Vs-2:EFs40 （40%乙二醇+60% Fs）和EDFs40 （40%乙二醇+20%二甲亚砜+20%Fs）。本研究所用的玻璃化冷冻液全部用10% NCs TCM199配制,用前在39℃条件下预热,所有的实验操作均在室温条件下（22～24℃）进行。将所有胚胎随机分成3个组,分别使用3种不同的冷冻保护液进行OPs法玻璃化冷冻保存。每组胚胎先在含20%v/v乙二醇（EG20）的TCM-NBCs培养液中平衡5 min,再放入100μl冷冻保护液的液滴中平衡30 s,之后立即将胚胎装入OPs管并直接投入-196℃液氮中。存储在液氮罐中的胚胎采用直接解冻后进行体外培养。直接解冻法是将胚胎从液氮中取出后垂直浸入放有100μl 0.5 M蔗糖的NCs TCM培养皿中平衡5 min。胚胎移至100μl含0.25M蔗糖的NCs TCM中再平衡5 min。所有的复苏液均在39℃条件下预热。最后胚胎用mPBs（?）先3次后置于39℃备用。玻璃化冷冻胚胎解冻后,通过FDA染色来鉴定胚胎是否存活。结果表明,与其它冷冻保护液相比,采用Es40冷冻保护剂可以获得最高的冻后存活率。此外,实验还证明Es40和EDFs40在冻后存活率上没有统计学差异（P＞0.05）,但均显著高于EFs40组。本研究结果表明猪体细胞核移植和小鼠-猪种间核移植胚胎可以成功地进行冷冻和复苏。但经OPs方法冷冻的2～8-细胞期的胚胎解冻后能否进一步向后期发育,仍需进行深入的研究。

关键词：猪体细胞核移植早期胚胎玻璃化冷冻

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