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猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用

中国畜牧兽医 2024年第3期51卷 1223-1231页

作者：李妍花周兵强康笃利郝丽影汪志艳赵少若黄甜庞杏豪刘俊阳楚园园张云静高晓静邓均华田克恭洛阳普泰生物技术有限公司洛阳471000 国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471000

【目的】利用2株猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于PoRV的临床快速检测。【方法】制备40 nm粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G5,将单克隆抗体5G4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测... 详细信息

【目的】利用2株猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于PoRV的临床快速检测。【方法】制备40 nm粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G5,将单克隆抗体5G4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测线和质控线。通过优化胶体金溶液最适pH、标记抗体和检测抗体的最佳使用量,制备PoRV胶体金检测试纸条;对试纸条的灵敏度、敏感性、特异性、重复性和稳定性进行评价。通过检测50份猪粪便样品,计算试纸条与RT-PCR方法的符合率,最后采用试纸条进行1249份临床样品的测定。【结果】经优化后试纸条的最佳参数如下:胶体金溶液最佳pH为8.0,标记抗体4G5和检测抗体5G4最佳使用量分别为14.4μg/mL和1 mg/mL。试纸条能检测出1∶2000稀释的PoRV OSU株(G5型)病毒液,灵敏度为104.5TCID50/mL,且检测PoRV G9、G3和G4型毒株均为阳性。检测猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)均为阴性。批内和批间重复性、稳定性良好。检测50份猪粪便样品,与RT-PCR方法的阳性符合率为97.5%(39/40),阴性符合率为100%(10/10),总体符合率为98%(49/50)。检测2022年在河南、山西省猪场收集的临床样品1249份,阳性检出率为5.2%。【结论】本研究制备的PoRV胶体金检测试纸条具有良好的敏感性、特异性和重复性等优点,与RT-PCR方法的符合率较高,可用于规模化猪场PoRV的快速检测。

关键词：猪轮状病毒(PoRV) 胶体金检测试纸条快速检测

Identification of a thioredoxin reductase(TrxR) from Babesia microti

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非洲猪瘟病毒p11.5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

中国动物学会寄生虫学专业委员会第十届全国寄生虫学青年工作者学术研讨会

作者： Haiyan Gong shaoruo zhao Kang Xiong Hao Zhang Houshuang Zhang Yongzhi Zhou Jie Cao Jinlin Zhou Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture Shanghai Veterinary Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences

Babesia, a kind of tick-borne pathogen to infect mammals including human, causes a great lose for the husbandry and threats the health of human. The drugs for babesiosis always bring side effect and drug resistance, thus the development of new drugs or vaccines seems important and necessary. As it lives in the red blood cell and surrounded by reactive oxygen species(ROS), Babesia involved the thioredoxin(Trx) system to deal with the oxidative stress. Aims: In order to explore the Trx system from Babesia, the transcriptome of the parasite was sequenced, and from which a Trx reductase(TrxR) was isolated and characterized. Method: The full length of TrxR was obtained by 3’ and 5’ RACE. The gene was ligated into pE T-30 a and the recombinant protein was purified for antibody preparation and enzymetic activity analysis. The native TrxR from B. microti(Bmi TrxR) was identified by Western blotting and IFAT. Results: TrxR is a putative 553 amino acids protein with a full length of 1766 bp and a signal peptide of 18 amino acids. The deduced protein sequence showed a highest homology to B. bovis TrxR(XP01608869, 58%), and 44% to human TrxR. The recombinant protein of TrxR showed reductive activity to DTNB, which is concentration dependent and can be inhibited by Auranofin. The optimum p H value for the reaction is 6.5. The native protein Bmi TrxR with a molecular size of 58.4 k Da was detected with the mouse anti-Bmi TrxR polyclonal serum by western blotting. IFAT result indicates that Bmi TrxR may localize in the cytoplasm of B. microti. Conclusion: A TrxR from B. microti was isolated and functionally identified in the present study. It provided information for the understanding the mechanism of Trx system and for the development of novel drugs to prevent B. microti infection.

关键词： Babesia microti transcriptome Trx R reductive activity

来源： cnki会议评论

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畜牧与兽医 2021年第10期53卷 77-82页

作者：赵少若梁严予郑丁丁王彦伟郝丽影逄文强邓均华田克恭洛阳普泰生物技术有限公司河南洛阳471000 国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000

为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.... 详细信息

为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.5蛋白。经Western blot鉴定,重组ASFV p11.5蛋白可被ASFV标准阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的p11.5蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞法,制备了4株可稳定分泌抗ASFV p11.5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体重链亚类为IgG1,1株重链亚类为IgG2a,轻链亚类均为κ。采用p11.5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价均不低于1∶102.4×10^(4)。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,4株单克隆抗体,均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒发生交叉反应,但均能与ASFV反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性和反应性。本试验为p11.5蛋白结构功能、免疫学特性及ASFV诊断试剂产品的研究提供了重要的生物材料。

关键词：非洲猪瘟病毒原核表达 p11.5蛋白单克隆抗体

非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的表达与单克隆抗体的制备

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畜牧与兽医 2021年第2期53卷 77-81页

作者：赵少若王孟月白晶晶郝丽影梁严予关洋邓均华田克恭洛阳普泰生物技术有限公司河南洛阳471000 国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)DP96R蛋白单克隆抗体,根据大肠杆菌密码子优化后的DP96R基因序列设计引物,PCR扩增后连接表达载体pET28a-SUMO构建pET-SUMO-DP96R原核表达质粒,将该质粒转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导,获得可溶性的DP96R蛋白... 详细信息

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)DP96R蛋白单克隆抗体,根据大肠杆菌密码子优化后的DP96R基因序列设计引物,PCR扩增后连接表达载体pET28a-SUMO构建pET-SUMO-DP96R原核表达质粒,将该质粒转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导,获得可溶性的DP96R蛋白。通过Western blot鉴定该蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,共制备了14株针对DP96R蛋白的单克隆抗体。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1、IgG2a,轻链亚类均为κ。采用DP96R蛋白为抗原的间接ELISA方法检测抗体的效价均不低于1∶2 560 000, 14株单克隆抗体均能够特异性识别DP96R蛋白。本试验为进一步研究DP96R蛋白生物学功能及ASFV基因缺失疫苗开发提供了重要的生物材料。

关键词：非洲猪瘟病毒原核表达 DP96R蛋白单克隆抗体

犬轮状病毒单克隆抗体制备及胶体金试纸条检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2022年第11期49卷 4429-4437页

作者：赵少若黄甜郝丽影吴洪超汪志艳崔宁宁王亚玲邓均华田克恭洛阳普泰生物技术有限公司洛阳471000 国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471000 北京金诺百泰生物技术有限公司北京101300

【目的】研发犬轮状病毒(Canine ratavirus,CRV)免疫学诊断试剂,制备并鉴定CRV特异性单克隆抗体,建立可用于检测CRV的胶体金免疫层析法。【方法】以CRV临床分离株SL006株为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,用杂交瘤细胞法进行细胞融合,通过间... 详细信息

【目的】研发犬轮状病毒(Canine ratavirus,CRV)免疫学诊断试剂,制备并鉴定CRV特异性单克隆抗体,建立可用于检测CRV的胶体金免疫层析法。【方法】以CRV临床分离株SL006株为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,用杂交瘤细胞法进行细胞融合,通过间接免疫荧光法(IFA)筛选可稳定分泌CRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并制备腹水,亲和层析法进行纯化获得单克隆抗体。对获得的单克隆抗体进行鉴定,经条件优化建立胶体金试纸条检测方法,对试纸条的灵敏度、特异性、重复性和应用情况进行评价。【结果】获得了4株杂交瘤细胞,分别命名为2C12、4A5、1H3、5F3,IFA效价分别为1∶6400、1∶12800、1∶1600和1∶3200;重链亚类分别为IgG2b、IgG2a、IgG1和IgG2a,轻链亚类均为kappa;制备的胶体金试纸条检测线包被单克隆抗体4A5,对照线包被羊抗鼠IgG,金标垫包被胶体金标记的单克隆抗体2C12,对CRV病毒液的检测灵敏度为10TCID/mL,检测犬源其他病毒犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)、犬腺病毒Ⅰ型(Canine adenovirus-Ⅰ,CAV-Ⅰ)、CAV-Ⅱ、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)病毒液及CRV阴性肛拭子和阴性粪便均为阴性;批内和批间重复性良好;利用制备的胶体金试纸条和RT-PCR方法对47份样品进行检测比较,两者符合率为93.6%。【结论】本研究建立的CRV胶体金试纸条检测方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,与RT-PCR方法符合率较高,可为CRV的临床快速诊断提供有效的检测方法。

关键词：犬轮状病毒(CRV) 单克隆抗体胶体金试纸条

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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

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畜牧与兽医 2020年第11期52卷 60-66页

作者：赵少若郝丽影王同燕贺笋郑丁丁李俊辉白晨雨王遵宝宋欢欢邓均华田克恭洛阳普泰生物技术有限公司河南洛阳471000 国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000 普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳471000 天康生物股份有限公司新噩乌鲁木齐830032

为了建立一种经济可靠的猪瘟病毒(CSFV)抗体检测方法,本研究利用杆状病毒表达系统表达可溶性CSFV E2蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备了45株可稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。经CSFV阳性血清阻断试验筛选出4株具有阻断... 详细信息

为了建立一种经济可靠的猪瘟病毒(CSFV)抗体检测方法,本研究利用杆状病毒表达系统表达可溶性CSFV E2蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备了45株可稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。经CSFV阳性血清阻断试验筛选出4株具有阻断活性的McAb,并经抗原表位鉴定确定单抗15A9识别的是可用于鉴别CSFV和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的线性表位TAVSPTTLR。利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的15A9建立了CSFV阻断ELISA抗体检测方法,用此方法检测猪瘟疫苗免疫的猪血清,免疫后2周即可检测到抗体,且该方法检测BVDV阳性血清为阴性。本研究建立的CSFV阻断ELISA抗体检测方法为CSFV的疫苗免疫效果评估及其与BVDV的抗体鉴别提供了一种有效、便捷的方法。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体阻断ELISA