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工程化大肠杆菌用于合成甘露糖—6—磷酸和蛛丝蛋白Masp2

工程化大肠杆菌用于合成甘露糖—6—磷酸和蛛丝蛋白Masp2

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作者： shafaq parveen 北京化工大学

学位级别：硕士

甘露糖-6-磷酸(M6P)是一种重要的磷酸糖,其可以参与多种生理功能,在药物合成方面有重要应用。然而,传统方法生产甘露糖-6-磷酸需要用ATP作为磷酸供体,合成成本高昂。为了解决这一问题,在本课题中,我们以甘露糖为底物,使用无机多磷酸盐... 详细信息

甘露糖-6-磷酸(M6P)是一种重要的磷酸糖,其可以参与多种生理功能,在药物合成方面有重要应用。然而,传统方法生产甘露糖-6-磷酸需要用ATP作为磷酸供体,合成成本高昂。为了解决这一问题,在本课题中,我们以甘露糖为底物,使用无机多磷酸盐为磷酸供体,利用甘露糖激酶(glucomannokinase)催化合成M6P,从而避免ATP的使用。我们从草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)中克隆出甘露糖激酶基因,并将其转化到大肠杆菌中进行诱导表达,随后获得的酶被纯化。甘露糖激酶蛋白大小30kDa,纯化结果由蛋白电泳检测。最终,我们获得了 0.69mg/mL的甘露糖激酶,其纯度超过90%。动力学研究表明,该酶对多磷酸盐和葡萄糖的催化性能优于ATP和甘露糖,其米氏常数KM值分别为1.7μM,9.5 μM,4.6 μM和203.7 μM。进一步实验表明,甘露糖-6-磷酸生产的最适反应条件是:pH8.5,25℃,多磷酸盐/甘露糖=3:1。另外,一定浓度的Mg2+有助于提高酶活性。结果说明来自草分枝杆菌的葡糖甘露糖酶有工业化生产甘露糖-6-磷酸的潜力。此外,本课题还进行了另一方面的研究——蛛丝蛋白的MaSp2的合成。丝是一种重要的生物产品,其可以用来制作许多重要的生物材料,如缝合线等。一般地,丝含有两种重要的蛋白质,壶腹蛛丝蛋白1和2(MaSp1;MaSp1)。在本课题中,我们尝试使用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主,人工合成MaSp2。起初,我们构建了名为gene unit的丝基因的单体单元(约100bp)。随后,这些单链寡核苷酸gene unit被头尾连接,以得到不同长度的聚合gene unit(聚合度为2-64)。这些聚合gene unit被插入到质粒中。质粒pET28a(+)和pET22b(+)分别带有MaSp2和Ala/glyc-tRNA基因,其被转化到在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达。重组大肠杆菌在含有0.05%丙氨酸和甘氨酸的培养基中培养(避免蛋白翻译在早期停止)。最终,我们得到了大小为55和110 kDa的人工MaSp2蛋白。结果说明了 MaSp2能够被人工合成,工程化大肠杆菌可以被用于表达高分子量和具有重复氨基酸序列的蛋白质。

关键词： 6-磷酸甘露糖甘露糖激酶聚磷酸盐丝蛋白壶腹蛛丝蛋白

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