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One-step base editing in multiple genes by direct embryo injection for pig trait improvement

Science China(Life Sciences) 2022年第4期65卷 739-752页

作者： ruigao song Yu Wang Qiantao Zheng Jing Yao Chunwei Cao Yanfang Wang Jianguo Zhao State Key Laboratory of Stem cell and Reproductive Biology Institute of ZoologyChinese Academy of SciencesBeijing100101China University of Chinese Academy of Sciences Beijing100049China State Key Laboratory of Animal Nutrition Institute of Animal ScienceChinese Academy of Agricultural SciencesBeijing100081China Institute for Stem Cell and Regeneration Chinese Academy of SciencesBeijing100101China Beijing Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Beijing100101China The Third Hospital of Shanxi Medical University Shanxi Bethune HospitalShanxi Academy of Medical SciencesTaiyuan030032China

The precise and simultaneous acquisition of multiple beneficial alleles in the genome is in great demand for the development of elite pig breeders. Cytidine base editors(CBEs) that convert C:G to T:A have emerged as powerful tools for single-nucleotide replacement. Whether CBEs can effectively mediate C-to-T substitution at multiple sites/loci for trait improvement by direct zygote injection has not been verified in large animals. Here, we determined the editing efficiency of four CBE variants in porcine embryonic fibroblast cells and embryos. The findings showed that hA3A-BE3-Y130F and hA3A-eBE-Y130F consistently resulted in increased base-editing efficiency and low toxic effects in embryonic development. Further, we verified that using a one-step approach, direct zygote microinjection of the CBE system can generate pigs harboring multiple point *** process resulted in a stop codon in CD163 and myostatin(MSTN) and introduced a beneficial allele in insulin-like growth factor-2(IGF2). The pigs showed disrupted expression of CD163 and MSTN and increased expression of IGF2, which significantly improved growth performance and infectious disease resistance. Our approach allows immediate introduction of multiple mutations in transgene-free animals to comprehensively improve economic traits through direct embryo microinjection,providing a potential new route to produce elite pig breeders.

关键词： CBEs embryo injection pig multiple traits improvement

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Base editing in pigs for precision breeding

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Frontiers of Agricultural Science and Engineering 2020年第2期7卷 161-170页

作者： ruigao song Yu WANG Yanfang WANG Jianguo ZHAO State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology Institute of ZoologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China Medical School University of Chinese Academy of SciencesBeijing 100049China State Key Laboratory'of Animal Nutrition Institute of Animal ScienceChinese Academy of Agricultural SciencesBeijing 100081China

Pigs are one of the most important domesticated animals and have great value in agriculture and *** nucleotide polymorphisms(SNPs)are a dominant type of genetic variation among individual pigs and contribute to the formation of *** single base substitution provides a strategy for accurate genetic improvement in pig production with the characterization of functional SNPs and genetic variants in *** editing has recently been developed as the latest gene-editing tool that can directly make changes in single nucleotides without introducing double-stranded DNA breaks(DSBs),providing a promising solution for precise genetic modification in large *** review summarizes gene-editing developments and highlights recent genetic dissection related to SNPs in major economic traits which may have the potential to be modified using SNP-editing *** addition,limitations and future directions of base editing in pig breeding are discussed.

关键词： base editing genetic improvement pigs single nucleotide polymorphisms

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A harlequin ichthyosis pig model with a novel ABCA12 mutation can be rescued by acitretin treatment

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Journal of Molecular Cell Biology 2019年第12期11卷 1029-1041页

作者： Xiao Wang Chunwei Cao Yongshun Li Tang Hai Qitao Jia Ying Zhang Qiantao Zheng Jing Yao Guosong Qin Hongyong Zhang ruigao song Yanfang Wang Guanghou Shui Sin Man Lam Zhonghua Liu Hong Wei Anming Meng Qi Zhou Jianguo Zhao State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology Institute of ZoologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China State Key Laboratory of Animal Nutrition Institute of Animal ScienceChinese Academy of Agricultural SciencesBeijing 100081China State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology Institute of Genetics and Developmental BiologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China College of Life Science Northeast Agricultural University of ChinaHarbin 150030China Department of Laboratory Animal Science College of Basic Medical SciencesThird Military Medical UniversityChongqing 400038China School of Life Sciences Tsinghua UniversityBeijing 100084China Chinese Swine Mutagenesis Consortium Beijing 100101China

Harlequin ichthyosis (HI) is a severe genetic skin disorder and caused by mutation in the ATP-binding cassette A12 (ABCA12) gene. The retinoid administration has dramatically improved long-term survival of HI, but improvements are still needed. However, the ABCA12 null mice failed to respond to retinoid treatment, which impedes the development of novel cure strategies for HI. Here we generated an ethylnitrosourea mutagenic HI pig model (named Z9), which carries a novel deep intronic mutation IVS49-727 A>G in the ABCA12 gene, resulting in abnormal mRNA splicing and truncated protein production. Z9 pigs exhibit significant clinical symptom as human patients with HI. Most importantly, systemic retinoid treatment significantly prolonged the life span of the mutant pigs via improving epidermal maturation, decreasing epidermal apoptosis, and triggering the expression of ABCA6. Taken together, this pig model perfectly resembles the clinical symptom and molecular pathology of patients with HI and will be useful for understanding mechanistic insight and developing therapeutic strategies.

关键词： harlequin ichthyosis ABCA12 pig model acitretin ENU mutagenesis deep intronic mutation

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碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

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中国畜牧兽医 2020年第11期47卷 3427-3435页

作者：王煜宋瑞高赵建国王彦芳中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 中国科学院动物研究所北京100101

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast cells,PFFs)中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的I... 详细信息

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast cells,PFFs)中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3072 bp处的单核苷酸多态性(SNP)位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3(P<0.05)。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失(indels);hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率(56.86%和40.38%)虽低于hA3A-BE3(71.43%),但是indels的效率也较低(31.37%和21.15%)。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。

关键词：碱基编辑器 IGF2基因定点突变猪胎儿成纤维细胞(PFFs)

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农村薄弱学校运用现代教育技术的思考

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基础教育研究 2006年第3期 29-30页

作者：宋瑞高廖贵荣广西富川县教研室 5427000

农村薄弱学校的产生有着较为深刻的历史原因和社会原因，并成为实施九年制义务教育和全面推进素质教育的重要障碍。近几年来，政府和各地教育行政部门已认识到农村薄弱学校存在的严重弊端，将加强学校建设作为推进素质教育的一个突破口... 详细信息

农村薄弱学校的产生有着较为深刻的历史原因和社会原因，并成为实施九年制义务教育和全面推进素质教育的重要障碍。近几年来，政府和各地教育行政部门已认识到农村薄弱学校存在的严重弊端，将加强学校建设作为推进素质教育的一个突破口，并有针对性地采取了一些措施。我们认为，在加强农村薄弱学校建设的过程中，应充分认识和发挥现代教育技术优化教学效果、提高教育质量的重要作用，将现代教育技术作为农村薄弱学校改造过程中提高教师教学水平、优化学生学习效果、全面推进素质教育的重要手段。

关键词：农村薄弱中小学现代教育技术九年制义务教育素质教育教学内容非智力因素

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A pig model carrying heterozygous point mutation of NCSTN simulates familial acne inversa and reveals dysregulated cholesterol biosynthesis via the Notch-p AMPK-HMGCR pathway

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Science Bulletin 2021年第23期66卷 2343-2346页

作者： ruigao song Keqiang Liu Yu Wang Guosong Qin Meng Xiao Yaping Liu Jun Yang Ruojun Zong Xinghui Yan Qiantao Zheng Hongyong Zhang Naipeng Hou Jing Yao Xiao Wang Yanfang Wang Jianguo Zhao Xue Zhang State Key Laboratory of Stem Cell and Reproductive Biology Institute of ZoologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China McKusick-Zhang Center for Genetic Medicine State Key Laboratory of Medical Molecular BiologyInstitute of Basic Medical SciencesChinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical CollegeBeijing 100005China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China State Key Laboratory of Animal Nutrition Institute of Animal ScienceChinese Academy of Agricultural SciencesBeijing 100081China Institute for Stem Cell and Regeneration Chinese Academy of SciencesBeijing 100101China Beijing Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Beijing 100101China

Acne inversa(Al,OMIM#142690)is an autosomal dominant chronic inflammatory disease of the hair follicles[1].Despite medications and procedures aimed at treating Al,patient responses vary widely to different therapies,and no curative regimen or treatment is available[2].In 2010,our group first idenrified nicas-trin(NCSTN),an y-secretase component gene,as a pathogenic gene for familial Al patients[3].

关键词： Notch信号通路猪模型皮肤屏障皮肤炎症背部皮肤表皮层动物模型点突变

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畜牧兽医学报 2021年第5期52卷 1317-1327页

作者：石磊牛宏泽姚晓磊宋瑞高吕丽华张春香张建新任有蛇山西农业大学动物科学学院太谷030801

旨在研究不同饲喂水平对绵羊睾丸发育、睾酮(T)合成相关基因与雄激素受体(androgen receptor,AR)表达的影响。本研究采用单因素完全随机试验设计,将18只健康、体重相近((35±0.5)kg)的杜泊羊(♂)×晋中绵羊(♀)杂F1代4月龄公羔随机分为3... 详细信息

旨在研究不同饲喂水平对绵羊睾丸发育、睾酮(T)合成相关基因与雄激素受体(androgen receptor,AR)表达的影响。本研究采用单因素完全随机试验设计,将18只健康、体重相近((35±0.5)kg)的杜泊羊(♂)×晋中绵羊(♀)杂F1代4月龄公羔随机分为3组,每组6只,分别按照自由采食(AL组)、自由采食量的65%(AL65组)和自由采食量的40%(AL40组)3个水平进行饲喂。当AL组任意1只羔羊体重达到50 kg时全部屠宰,测定睾丸的周径与长度后采集睾丸组织,通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H-E)染色观察曲精细管生精上皮结构;酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法测定睾酮(testosterone,T)的水平;用定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测T合成相关基因和AR mRNA的表达情况;通过免疫组化和Western blotting的方法对绵羊睾丸组织中的AR进行定位与定量分析。结果表明,AL40组羔羊睾丸周径和长度显著低于AL组(P0.05);AL40组曲精细管生精上皮厚度与AL65组差异不显著(P>0.05),但均显著低于AL组(P<0.05)。随着饲喂水平的提高,生精细胞和间质细胞密度显著增加(P<0.05),T水平和STAR、3β-HSD基因以及AR mRNA和蛋白表达量均显著提高(P<0.05);睾丸间质细胞、初级精母细胞、精子细胞、管壁肌样细胞层和间质血管平滑肌细胞中均观察到AR阳性产物。综上所述,绵羊的睾丸发育、T含量、T合成相关基因和AR的表达均受到日粮营养水平的调控。日粮营养水平可能通过改变T水平和生精细胞对T的敏感性来调控精子发生过程,从而影响其性成熟和繁殖性能。

关键词：饲喂水平绵羊睾丸睾酮雄激素受体

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