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A Bifunctional Xylanase-Glucanase with a Single Catalytic Domain from Paenibacillus sp.E18

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A Bifunctional Xylanase-Glucanase with a Single Catalytic Do...

第八届中国酶工程学术研讨会

作者： pengjun shi Tiezheng Yuan Huoqing Huang Xiaoyan Chen Yingguo Bai Huiying Luo Peilong Yang Bin Yao Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture Feed Research Institute

Hemicelluloses are the major constituents of plant cell walls.β-1,4-Xylans are mainly found in secondary cell walls of plants,and the mixed linked 1,3-1,4-β-glucans form the major part of cell walls of cereals like oat and *** in conjunction with other enzymes,such as cellulases,glucanases and proteases,are widely used in animal feed,brewing,food processing,waste treatment,as well as in

关键词：

来源： cnki会议评论

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浅谈定积分区间可加性的应用

科教文汇 2014年第23期 54-54,56页

作者：史鹏军陕西省建筑职工大学陕西西安710068

定积分的性质在解决定积分计算的相关问题中起重要作用,本文通过典型例题介绍了定积分区间可加性的应用,提高了解题效率。

关键词：定积分区间可加性分段函数

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嗜热古菌Infirmifilum uzonense来源的双功能高温β-葡萄糖苷酶IuBgl3的原核表达及酶学性质分析

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生物工程学报 2022年第12期38卷 4644-4657页

作者：刘鑫涵沈风飞石鹏君刘慧芹天津农学院园艺园林学院天津300392 江西农业大学生物科学与工程学院江西南昌330045 中国农业科学院麻类研究所湖南长沙410205 中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究热点。本研究从嗜热古菌Infirmifilum uzonense中成功克隆出一个GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,命名为Iubgl3。基因... 详细信息

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究热点。本研究从嗜热古菌Infirmifilum uzonense中成功克隆出一个GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,命名为Iubgl3。基因序列分析显示Iubgl3全长为2109 bp,编码702个氨基酸,理论分子量为77.0 kDa。将该基因在大肠杆菌中进行克隆表达并对纯化后的IuBgl3进行酶学性质研究。结果显示,重组酶IuBgl3最适pH 5.0,最适温度85℃。该酶具有良好的热稳定性,80℃处理2 h后仍能保持85%以上的酶活力。其具有优良的pH稳定性,在pH 4.0-11.0范围内处理1 h,仍维持85%以上的酶活力。通过底物特异性测定发现,该酶对对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl β-D-glucoside,p NPG)和对硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(p-nitrophenyl β-D-xylopyranoside,p NPX)均有很高的水解能力,是典型的双功能酶。以p NPG为底物时的动力学参数K_(m)和V_(max)分别为0.38 mmol和248.55μmol/(mg·min),催化效率k_(cat)/K_(m)=6149.20 s^(-1)mmol^(-1)。大多数金属离子对IuBgl3的酶活力没有显著影响,SDS可导致酶完全失活,而EDTA却能提高30%的酶活力。本研究丰富了高温古菌GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,获得了一个稳定性优良的高温酸性双功能酶,具有良好的工业应用前景。

关键词：嗜热古菌 GH3家族 β-葡萄糖苷酶酶学性质双功能酶

植物乳杆菌WU146-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白表达及生物信息学分析

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中国食品学报 2022年第6期22卷 62-71页

作者：缪婷婷沈风飞张晓晓邱胡林徐波尹爱国石鹏君江西农业大学生物科学与工程学院南昌330045 广东石油化工学院生物与食品工程学院广东茂名525000 中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反... 详细信息

植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)技术成功克隆了8个WU14的糖苷水解酶,生物信息学分析表明均为糖苷水解酶1家族(GH1)的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。鉴于植物乳杆菌中该类糖苷酶鲜有报道,采用原核异源表达展开研究。序列分析表明8个酶蛋白氨基酸序列具有GH1家族的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶典型的2个保守催化位点,序列一致性在32%~74%之间。经SDS-PAGE,8个蛋白均在大肠杆菌中表达,其中BglAW14、BglCW14、BglFW14为部分可溶性表达,其余为蛋白表达,形成包涵体。生物信息学分析显示:8个基因的编码蛋白都无信号肽和跨膜结构,疏水性较强。由亚细胞定位预测可知,除BglEW14主要存在于分泌结构内和BglHW14主要存在于细胞膜外,其余6个基因都存于细胞质内。对8个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及生物学序列分析,为进一步探究植物乳杆菌来源的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的分子机理研究奠定了基础。

关键词：植物乳杆菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因克隆蛋白表达生物信息学分析

嗜热古菌Thermofilum adornatum来源的高温热激活β-葡萄糖苷酶TaBgl3的原核表达及酶学性质研究

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微生物学报 2022年第7期62卷 2555-2567页

作者：沈风飞缪婷婷张晓晓尹爱国石鹏君徐波江西农业大学生物科学与工程学院江西南昌330045 广东石油化工学院生物与食品工程学院广东茂名525000 中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

【目的】β-葡萄糖苷酶,又称β-D-葡萄糖苷水解酶,属于纤维素酶类,是一种降解纤维素的关键限速酶。来源于嗜热古菌的β-葡萄糖苷酶已被广泛验证具有酸性高温等特性,已成为高温酶的研究热点之一。本文对尚未报道的来源于嗜热古菌中一种... 详细信息

【目的】β-葡萄糖苷酶,又称β-D-葡萄糖苷水解酶,属于纤维素酶类,是一种降解纤维素的关键限速酶。来源于嗜热古菌的β-葡萄糖苷酶已被广泛验证具有酸性高温等特性,已成为高温酶的研究热点之一。本文对尚未报道的来源于嗜热古菌中一种热丝菌(Thermofilum adornatum)的GH3家族的葡萄糖苷酶,进行了原核表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。【方法】从NCBI数据库中获得了嗜热古菌(***)来源的GH3氨基酸序列,构建重组质粒p ET-30a(+)-TaBgl3,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达重组蛋白;采用磁珠纯化,研究其酶学性质。【结果】重组蛋白TaBgl3的分子量为77.0 kDa;酶学性质结果表明,其最适反应条件为80℃和pH 5.0,在70℃保温处理1–4 h,对TaBgl3的酶活力有促进作用,在最适温度80℃处理2 h后,其激活作用更加明显,能提高40%以上的酶活;其在pH 5.0–8.0下37℃保温1 h,仍具有60%以上的活性;底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)时酶的比活力为144.23 U/mg,米氏常数K值和最大反应速率V分别为1.81 mmol/L和268.10μmol/(mg·min),催化效率为115.47/s;终浓度为5 mmol/L的Cu、Li和EDTA对TaBgl3的酶活有较大的促进作用,可提升39%以上的酶活,而5 mmol/L Fe和5%β-巯基乙醇对酶活有抑制作用,SDS、乙醇和葡萄糖对酶具有很强的抑制作用。【结论】本研究中,TaBgl3是酸性高温酶,且具有较好的热稳定性和热激活特性,这些特征在以后的理论研究及在工业生产中具有一定的科学价值。

关键词：嗜热古菌 GH3β-葡萄糖苷酶高温热激活酶热稳定性

毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

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微生物学报 2019年第1期59卷 37-47页

作者：李新新柏映国华晨马锐石鹏君罗会颖姚斌中国农业科学院饲料研究所北京100081

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比... 详细信息

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。

关键词：嗜热蓝状菌 β-葡萄糖苷酶 N-糖基化热稳定性催化效率

Achaetomium ***8甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达及其酶学性质分析

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核农学报 2015年第1期29卷 87-94页

作者：李文革石鹏君卢海强姚斌张祺玲戴良英湖南农业大学湖南长沙410128 湖南省农业科学院湖南长沙410125 中国农业科学院饲料研究所北京10081

甘露聚糖酶作为最主要的半纤维素酶类现已被广泛地应用在饲料、造纸、洗涤剂、食品及石油开采等领域。本研究从高温真菌Achaetomium ***8菌株中利用兼并引物和Thermal asymmetric interlaced PCR（Tail-PCR）的方法克隆获得一个新的糖... 详细信息

甘露聚糖酶作为最主要的半纤维素酶类现已被广泛地应用在饲料、造纸、洗涤剂、食品及石油开采等领域。本研究从高温真菌Achaetomium ***8菌株中利用兼并引物和Thermal asymmetric interlaced PCR（Tail-PCR）的方法克隆获得一个新的糖苷水解酶5家族的甘露聚糖酶基因（man5Xz8）。基因全长1 239bp,序列分析发现其编码412个氨基酸和1个终止密码子,预测的信号肽序列为N端的20个氨基酸。将成熟蛋白序列克隆到毕赤酵母分泌型表达载体p PIC9中,利用甲醇诱导重组酵母菌表达目的蛋白,经SDS-PAGE电泳分析,表达蛋白分子量约55.0 k Da。对其酶学性质进行测定,Man5Xz8的最适p H值为5.0,在p H值9.0可以保持40%以上的酶活性,在p H值5.0~9.0具有良好的p H稳定性。最适作用温度为50℃,并对SDS具有较高的耐受性。以角豆胶为底物,Man5Xz8的比活、Km及Vmax值分别为101.6 U·mg-1、4.4 mg·m L-1、128.2μmol·min-1·mg-1。因此,Man5Xz8为后期研究甘露聚糖酶的工业应用和酸碱催化机制提供了良好的材料。

关键词： Achaetomium sp.Xz8 甘露聚糖酶克隆毕赤酵母酶学性质

来源于脂环酸芽孢杆菌的GH1家族β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性分子改造

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中国农业科技导报 2018年第5期20卷 26-33页

作者：曹慧方李新新张玥琦石鹏君柏映国姚斌中国农业科学院饲料研究所农业部饲料生物技术重点实验室北京100081

豆粕中大豆异黄酮主要以无活性的结合型存在。在玉米豆粕型日粮为主的饲料领域,β-葡萄糖苷酶可以将结合型大豆异黄酮转化为游离型活性苷元,但转化过程受肠道中较高浓度葡萄糖的抑制。和GH3家族相比,GH1家族β-葡萄糖苷酶不仅具有较高... 详细信息

豆粕中大豆异黄酮主要以无活性的结合型存在。在玉米豆粕型日粮为主的饲料领域,β-葡萄糖苷酶可以将结合型大豆异黄酮转化为游离型活性苷元,但转化过程受肠道中较高浓度葡萄糖的抑制。和GH3家族相比,GH1家族β-葡萄糖苷酶不仅具有较高的葡萄糖耐受性,而且一定浓度范围内的葡萄糖对其具有酶活促进效应,因此在饲料领域显示出巨大的应用潜力。从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.A4中克隆表达了一个具有较高葡萄糖耐受性(IC50800 mmol/L)的GH1家族β-葡萄糖苷酶As BG1。为了进一步提高As BG1的葡萄糖耐受性,通过同源建模、序列比对、分子对接技术等生物信息学手段,聚焦于催化通道的非催化葡萄糖结合位点,对As BG1进行了理性设计的分子突变研究。对不同突变体的葡萄糖耐受性测定表明:以5 mmol/L p NPG为底物,100 mmol/L葡萄糖对WT(野生型)、H315R和M325K酶活促进作用分别为125%、163%和162%,其中H315R的IC50提高至1 200 mmol/L;以1 mmol/L大豆苷为底物,10 mmol/L的葡萄糖对WT、H315R和M325K分别具有163%、212%和226%的酶活促进作用,结果表明突变体具有更好的在动物胃肠道水解大豆异黄酮能力。上述结果丰富了对GH1家族葡萄糖耐受性机制的认识,为日后进行耐受性相关的分子改造提供了重要的指导意义。

关键词： β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性分子改造大豆异黄酮

嗜酸古菌Cuniculiplasma divulgatum来源的GH1家族中温β-葡萄糖苷酶CdBglA的原核表达及酶学性质分析

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生物工程学报 2023年第11期39卷 4694-4707页

作者：何金见沈风飞刘鑫涵杨天均李宝通石鹏君刘慧芹曾婉宁天津农学院园艺园林学院天津300392 中国农业科学院麻类研究所湖南长沙410205 江西中洪博元生物技术有限公司江西南昌330200 绥江县兴邦农业开发有限公司云南昭通657700

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究的热点。本文对尚未报道的来源于嗜酸古菌(Cuniculiplasmadivulgatum)GH1家族的葡萄糖苷酶进行了克隆表达和酶学... 详细信息

葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究的热点。本文对尚未报道的来源于嗜酸古菌(Cuniculiplasmadivulgatum)GH1家族的葡萄糖苷酶进行了克隆表达和酶学性质测定,以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。从NCBI数据库中获取了***来源的GH1葡萄糖苷酶氨基酸序列,然后制备重组质粒pET-30a(+)-CdBglA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白,对纯化后的CdBglA进行酶学性质研究。结果发现,重组酶CdBglA的分子量为56.0 kDa,最适pH为5.5,最适温度为55℃。该酶具有良好的pH稳定性,在pH 5.5-11.0范围内处理1 h,仍维持92.33%以上的酶活力。以p NPG为底物时的酶促反应动力学参数K_(m)、V_(max)和K_(cat)/K_(m)分别为0.81 mmol、291.99μmol/(mg·min)和387.50s^(-1)mmol^(-1)。其在终浓度5mmol/L重金属离子的影响下均能保持90.33%以上的酶活力;在15%的乙醇溶液中酶活力被提高了28.67%,在20%的乙醇溶液中酶活力保持不变,在30%的乙醇溶液中仍保持43.68%的酶活力;该酶在0-1.5 mol/L的Na Cl溶液中具有明显的激活作用并且可以耐受0.8mol/L葡萄糖。本研究表明,CdBglA是酸性中温酶,具有宽泛的pH稳定性,且对大部分金属离子、有机溶剂、NaCl和葡萄糖都具有很强的耐受性。这些特征在以后的理论研究及在工业生产中具有一定的科学价值。

关键词：嗜酸古菌 GH1家族 β-葡萄糖苷酶乙醇耐受性酶学性质