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Large-Scale CRISPR Screen of LDLR Pathogenic Variants

Research 2024年第2期2023卷 213-225页

作者： Mengjing Li Lerong Ma Yiwu Chen Jianing Li Yanbing Wang Wenni You Hongming Yuan Xiaochun Tang Hongsheng Ouyang daxin pang Key Lab for Zoonoses Research Ministry of EducationAnimal Genome Editing Technology Innovation CenterCollege of Animal SciencesJilin UniversityChangchunJilin Province 130062China The Institute of Translational Medicine Tianjin Union Medical Center of Nankai UniversityTianjin 300071China Chongqing ResearchInstitute Jilin UniversityChongqing 401123China Chongqing Jitang Biotechnology Research Institute Co.Ltd. ChongqingChina

Familial hypercholesterolemia(FH)is a frequently occurring genetic disorder that is linked to early-onset cardiovascular *** left untreated,patients with this condition can develop severe cardiovascular ***,many patients remain undiagnosed,and even when diagnosed,the treatment is often not *** mutations in the LDLR gene are the primary cause of FH,predicting whether novel variants are pathogenic is not a straightforward *** the functionality of LDLR variants is crucial in uncovering the genetic basis of *** study utilized CRISPR/Cas9 cytosine base editors in pooled screens to establish a novel approach for functionally assessing tens of thousands of LDLR variants on a large scale.A total of more than 100 single guide RNAs(sgRNAs)targeting LDLR pathogenic mutations were successfully screened with relatively high *** of these,5 sgRNAs were further subjected to functional verification studies,including 1 in the promoter,1 in the antisense RNA,1 in the exon,and 2 in the *** for the variant caused by the sgRNA located at intron 16,the functionalities of the other LDLR variants were all *** high similarity of LDLR intron sequences may lead to some false ***,these results confirm the reliability of the large-scale screening strategy for functional analysis of LDLR variants,and the screened candidate pathogenic mutations could be used as an auxiliary means of clinical gene detection to prevent FH-induced heart disease.

关键词： LDLR Screen straight

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Scriptaid affects histone acetylation and the expression of development-related genes at different stages of porcine somatic cell nuclear transfer embryo during early development

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Chinese Science Bulletin 2013年第18期58卷 2044-2052页

作者： ZHOU Yan HUANG YongYe XIE WanHua SONG Qi JI Yuan ZHANG YanPing OUYANG HongSheng LAI LiangXue pang daxin TANG XiaoChun Jilin Provincial Key Laboratory of Animal Embryo Engineering College of Animal Science and Veterinary MedicineJilin University College of Life Science and Technology Dalian University

Although the somatic cell nuclear transfer(SCNT) technique has been used extensively for cloning and generating transgenic pigs,the cloning efficiency is still very *** has been proposed that the low efficiency of this technique is the result of incomplete epigenetic reprogramming and abnormal gene expression during early embryonic *** this study,we investigate the effect of Scriptaid,a low-toxicity histone deacetylase inhibitor,on the developmental competence of porcine SCNT *** found that treating SCNT embryos with 500 nmol/L Scriptaid for 15 h after activation significantly enhanced the blastocyst formation rate(27.7%) compared with the untreated group(control)(12.2%,P<0.05).Using an immunofluorescence technique to measure the average fluorescence intensity,we also found that treating SCNT embryos with Scriptaid increased the level of histone acetylation on histone H3 at lysine 14(acH3K14).Furthermore,treating embryos with Scriptaid increased the expression level of three genes that play important roles during embryonic development(Oct4,Klf4 at the blastocyst stage and Nanog at the 4-cell stage).Moreover,the expression level of the apoptosis-related gene Caspase-3 was significantly lower in the Scriptaid-treated SCNT embryos compared with the control SCNT embryos at the 4-cell and blastocyst *** conclusion,these results indicate that Scriptaid treatment improves the development and nuclear reprogramming of porcine SCNT embryos.

关键词：体细胞核移植胚胎组蛋白乙酰化转基因猪早期发育过程免疫荧光技术 Caspase-3 细胞凋亡相关基因克隆胚胎

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《全国报刊索引》在查新咨询工作中的作用

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中国科技期刊研究 1999年第4期10卷 277-278页

作者：逄大欣李玉玲白求恩医科大学图书馆长春市清华路30号130021

对1998年上半年《中文科技资料目录》与《全国报刊索引》的Q类生物科学(部分)、R类医药、卫生进行统计分析,结果显示,在与生物医学有关的查新工作中一定要检索《全国报刊索引》,特别是对基础研究、物质检测与分析、实验室诊断方面以及... 详细信息

对1998年上半年《中文科技资料目录》与《全国报刊索引》的Q类生物科学(部分)、R类医药、卫生进行统计分析,结果显示,在与生物医学有关的查新工作中一定要检索《全国报刊索引》,特别是对基础研究、物质检测与分析、实验室诊断方面以及一些边缘学科的课题检索。

关键词：期刊文献计量学查新咨询全国报刊索引索引

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DNA甲基化和组蛋白修饰在兔早期胚胎的动态分析

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吉林农业大学学报 2019年第2期41卷 241-247页

作者：王安峰黄永业逄大欣吉林大学动物科学学院长春130062 东北大学生命科学与健康学院沈阳110819

胚胎发育过程伴随着遗传学与表观遗传学不断变化,表观重编程完整性直接影响胚胎发育能力。孤雌胚胎发育可能与表观重编程不完全密切相关。然而,当前关于兔早期胚胎发育的表观遗传研究鲜有报道。研究拟确定兔早期胚胎中DNA甲基化与组蛋... 详细信息

胚胎发育过程伴随着遗传学与表观遗传学不断变化,表观重编程完整性直接影响胚胎发育能力。孤雌胚胎发育可能与表观重编程不完全密切相关。然而,当前关于兔早期胚胎发育的表观遗传研究鲜有报道。研究拟确定兔早期胚胎中DNA甲基化与组蛋白修饰动态分布,比较这些表观修饰在体内受精胚胎与孤雌胚胎的差异。结果表明:体内受精胚胎与孤雌胚胎均呈现较高H3K4me2和泛乙酰化丰度,而较低H3K27me2和巴豆酰化丰度。四细胞到囊胚时期,孤雌胚胎5-甲基胞嘧啶(5mC)含量高于体内受精胚胎。二细胞到桑椹胚时期,孤雌胚胎5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)水平高于体内受精胚胎。培养基添加维生素C并没有显著改善孤雌胚胎DNA甲基化状态,而应用5-Aza-dC处理58 h能够降低5mC和5hmC水平,说明使用化合物进行适当处理可以改善孤雌胚胎的表观修饰水平。

关键词：孤雌胚胎组蛋白甲基化兔

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茎环法RT-qPCR定量检测细胞抗猪瘟病毒siRNA的表达

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生物工程学报 2012年第1期28卷 26-36页

作者：刘帅李江南袁婷杨凡力逄大欣涂长春吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122

RNAi(RNA interference)已成为特异抗病毒治疗研究的热点,但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siN1和siN2)在细胞中的表达水平,设计并以交叉组合方法筛选了具有较高... 详细信息

RNAi(RNA interference)已成为特异抗病毒治疗研究的热点,但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siN1和siN2)在细胞中的表达水平,设计并以交叉组合方法筛选了具有较高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物(SLP-N1-6和SLP-N2-8),成功地建立了最优的siN1和siN2的茎环法RT-qPCR检测方法。该方法表现出良好的特异性和较高的灵敏度,能检测出102至108个拷贝的siRNA,至少可达7个数量级的检测范围,平行性好(Rsq=0.999),扩增效率高(Eff.=98.2%)。茎环法RT-qPCR能准确地定量检测抗CSFV的PK-15细胞克隆的siN1/siN2表达水平,可结合常规的检测病毒水平的间接免疫荧光和TCID50等技术定量评价RNAi抗CSFV的有效性,为未来抗猪瘟转基因猪的抗病毒效果评价提供了先进的检测技术。

关键词：抗猪瘟病毒小干扰RNA 茎环引物 MGB探针实时定量PCR

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牛气管抗菌肽在山羊乳腺组织中的表达

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中国农学通报 2009年第8期25卷 7-11页

作者：王铁东逄大欣欧阳红生吉林大学畜牧兽医学院长春130062

根据已经发表的牛气管抗菌肽(bTAP)cDNA序列设计4条短的寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR的方法合成bTAP基因,将其克隆至pMD-18T载体,序列测定正确后,构建bTAP基因的乳腺组织特异性表达载体pBcp-bTAP,将其溶于生理盐水后直接注射山羊乳腺小叶... 详细信息

根据已经发表的牛气管抗菌肽(bTAP)cDNA序列设计4条短的寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR的方法合成bTAP基因,将其克隆至pMD-18T载体,序列测定正确后,构建bTAP基因的乳腺组织特异性表达载体pBcp-bTAP,将其溶于生理盐水后直接注射山羊乳腺小叶,使bTAP基因在乳腺组织内表达,收集注射质粒前后的奶样,测试奶样对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的抑制能力,结果显示注射pBcp-bTAP后的奶样表现出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用,这种抑制活性可以持续至20h以上。

关键词：牛气管抗菌肽乳腺基因表达

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逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖

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中国农学通报 2009年第13期25卷 14-17页

作者：王铁东逄大欣欧阳红生吉林大学畜牧兽医学院长春130062

利用针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株。以100TCID50的CSFV分别感染96孔板... 详细信息

利用针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株。以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制。

关键词：猪瘟病毒猪胚胎成纤维细胞 RNA干扰逆转录病毒载体

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逆转录病毒介导的天蚕抗菌肽B在奶牛乳腺中的表达

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中国农学通报 2009年第10期25卷 6-10页

作者：王铁东逄大欣欧阳红生吉林大学畜牧兽医学院长春130062

为了研究天蚕抗菌肽在奶牛乳腺组织长期表达的可行性以及对大肠杆菌的抑制作用,将天蚕抗菌肽B(cecropin B,CB)的基因序列以哺乳动物偏爱的密码子优化后,合成了四条相互重叠的DNA片段,通过重叠延伸PCR法获得了天蚕抗菌肽B的基因,将其亚... 详细信息

为了研究天蚕抗菌肽在奶牛乳腺组织长期表达的可行性以及对大肠杆菌的抑制作用,将天蚕抗菌肽B(cecropin B,CB)的基因序列以哺乳动物偏爱的密码子优化后,合成了四条相互重叠的DNA片段,通过重叠延伸PCR法获得了天蚕抗菌肽B的基因,将其亚克隆至T载体,测序正确后构建逆转录病毒载体pLNCX-bCP-cecB,经过包装细胞的包装,获得含有天蚕抗菌肽B表达框的逆转录病毒,注射入奶牛乳腺组织,通过琼脂板孔穴扩散法检测基因的表达及活性;实验结果表明,克隆的抗菌肽基因在乳腺中获得了表达,表达产物对大肠杆菌具有抑制作用,抑制效果可以持续至13天以上。

关键词：抗菌肽天蚕素B 乳腺基因表达逆转录病毒

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双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的研究

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中国农学通报 2010年第14期26卷 34-36页

作者：李小平袁婷高飞武蓉黄永业段新平谢万华逄大欣吉林大学畜牧兽医学院长春130062

通过PCR扩增哺乳动物雄性决定基因SRY来鉴定胚胎的性别在畜牧业生产上已经得到广泛应用,优化技术路线,缩短鉴定时间对后期实验的成功有非常重要的意义。根据猪的SRY基因和GAPDH(内标)基因序列,分别设计并合成两对引物,通过双温PCR反应... 详细信息

通过PCR扩增哺乳动物雄性决定基因SRY来鉴定胚胎的性别在畜牧业生产上已经得到广泛应用,优化技术路线,缩短鉴定时间对后期实验的成功有非常重要的意义。根据猪的SRY基因和GAPDH(内标)基因序列,分别设计并合成两对引物,通过双温PCR反应实现对猪早期胚胎性别的快速鉴定,结果表明:母猪只能扩增出404bp的GAPDH基因片段,而公猪能同时扩增出309bp的SRY基因片段和404bp的GAPDH基因片段。阳性率为100%,鉴定时间较常规时间缩短2h时。表明该检测方法快速、准确。该方法为在转基因克隆动物研究中快速鉴定胎儿成纤维细胞系的性别提供了可靠的技术保证。

关键词： SRY基因双温PCR 多重PCR 性别鉴定

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使用poly(A)-tailed RT-PCR对猪部分microRNAs在胚胎期的表达进行验证

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中国农学通报 2011年第17期27卷 6-12页

作者：周焱宋齐王欢王海军朱建国逄大新欧阳红生唐小春吉林大学畜牧兽医学院吉林省动物胚胎工程重点实验室长春130062 吉林农业科技学院生物工程分院吉林132101

MicroRNAs(miRNAs)是一系列小的非编码的RNA,长度大约为21～22nt。主要通过抑制翻译或者进行mRNA的降解而在多种生理以及发育过程中发挥很重要的作用。miRB ase16.0(2010)数据库中显示,注释的线虫、小鼠、大鼠以及人的miRNAs分别有175种... 详细信息

MicroRNAs(miRNAs)是一系列小的非编码的RNA,长度大约为21～22nt。主要通过抑制翻译或者进行mRNA的降解而在多种生理以及发育过程中发挥很重要的作用。miRB ase16.0(2010)数据库中显示,注释的线虫、小鼠、大鼠以及人的miRNAs分别有175种、673种、408种和1048种。而哺乳动物猪的miRNAs仅仅为211种,特别是在胚胎生长发育过程中调节基因表达的miRNAs的研究十分欠缺。因此使用poly(A)-tailed RT-PCR对猪的10种miRNAs的表达在猪胚胎期第33天(E33)进行验证。对于鉴定的这10种miRNAs,通过实时定量PCR对其表达水平进行相对分析,并使用PicTar和TargetScan软件对其靶基因进行预测。结果表明:在头部组织中ssc-miR-9的表达量最高的,而在内脏组织中ssc-miR-1的表达量最高。功能分析表明这些miRNAs可以参与神经、大脑、肌肉、器官的发育。此研究为以后进一步的研究猪以及相关动物胚胎发育的miRNAs的功能提供有用的信息。

关键词： microRNA 猪胚胎发育 poly(A)-tailed PCR 靶标预测

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