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侵染构树的菜豆金色黄花叶病毒属病毒的鉴定及基因组序列分析

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植物病理学报 2024年第1期54卷 59-68页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵丁善文何自福广东省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

从广东省河源市连平县采集3份疑似双生病毒侵染引起的叶片表现黄花叶症状构树样品,提取总DNA,利用Bego-movirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测表明,疑似病样中均检测到菜豆金色黄花叶病毒属病毒。进一步选取PCR检测为阳性的样品进行RCA... 详细信息

从广东省河源市连平县采集3份疑似双生病毒侵染引起的叶片表现黄花叶症状构树样品,提取总DNA,利用Bego-movirus通用引物AV494/CoPR进行PCR检测表明,疑似病样中均检测到菜豆金色黄花叶病毒属病毒。进一步选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序,获得侵染广东构树的病毒分离物基因组全长序列。广东构树分离物(GS-2021)为一个双组分病毒,包含DNA-A和DNA-B两组分。DNA-A组分(GS-2021-A)全长为2777 nt,编码7个ORFs;DNA-B组分(GS-2021-B)为2742 nt,编码2个ORFs。GS-2021与已报道的中国大青金色花叶病毒(clerodendrum golden mosaic China virus,ClGMCNV)各分离物的DNA-A、DNA-B均有较高的一致性,全长序列的一致性分别为93.0%~93.9%和86.3%~89.6%,其中与福建Fz7分离物DNA-A(GenBank登录号:FJ011668)和DNA-B(GenBank登录号:FJ011669)的相一致性最高,为93.9%和89.6%。GS-2021与ClGMCNV福建、浙江、江苏和美国的5个分离物亲缘关系近,同属一个分支,其中与福建Fz7分离物聚集在一个小分支,亲缘关系最近。基因重组分析显示,GS-2021无明显的基因重组事件存在。根据ICTV对菜豆金色黄花叶病毒属病毒最新分类标准,GS-2021属ClGMCNV的一个新株系。本研究首次在构树上检测到菜豆金色花叶病毒属病毒,获得其病毒基因组全序列,明确其为ClGMCNV的新株系。因此,构树是菜豆金色黄花叶病毒属病毒的新自然寄主。

关键词：构树菜豆金色黄花叶病毒属中国大青金色花叶病毒病毒基因组新寄主

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类

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中国农业科学 2019年第13期52卷 2256-2267页

作者：汤亚飞裴凡李正刚佘小漫于琳蓝国兵邓铭光何自福广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛... 详细信息

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)(44.0%)、甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)(32.8%)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)(31.2%)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)(29.6%)、辣椒黄脉病毒1(Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1)(26.4%)、甜椒斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(25.6%)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)(18.4%)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)(16.8%)、辣椒黄脉病毒6(Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6)(16.8%)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)(15.2%)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus,Ca CV)(14.4%)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)(9.6%)、辣椒隐症病毒1(Pepper cryptic virus 1,PCV1)(8.8%)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)(4.0%)。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMo V、Chi VMV和PVMV分布广泛,PMMo V除了茂名外,Chi VMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMo V、Chi VMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMo V、Chi VMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。

关键词：辣椒病毒病种类鉴定小RNA深度测序 RT-PCR 广东省

黄瓜褐斑病(Corynespora cassiicola)在广东首次报道

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植物保护 2012年第5期38卷 197-200页

作者：蓝国兵谭耀华何自福罗方芳梁丽欢虞皓广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640 高要市农业技术推广中心广东526100

2011年5月和8月,在广东省高要市和增城市黄瓜主产区发现黄瓜褐斑病,致病性测定、形态学观察和rD-NA-ITS序列分析结果表明,引起广东黄瓜褐斑病的病原菌为多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)。本文是多主棒孢霉在广东引起黄瓜褐斑病的首... 详细信息

2011年5月和8月,在广东省高要市和增城市黄瓜主产区发现黄瓜褐斑病,致病性测定、形态学观察和rD-NA-ITS序列分析结果表明,引起广东黄瓜褐斑病的病原菌为多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)。本文是多主棒孢霉在广东引起黄瓜褐斑病的首次报道。

关键词：黄瓜褐斑病多主棒孢霉病原鉴定

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征及致病性分析

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中国农业科学 2020年第5期53卷 955-964页

作者：李正刚农媛汤亚飞佘小漫于琳蓝国兵邓铭光何自福广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并... 详细信息

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列(GenBank登录号:KX883801)设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F:CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R:TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F:AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R:AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F:GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R:GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶(61—3 495 nt)、186K复制相关蛋白(61—5 007 nt)、运动蛋白MP(4 994—5 788 nt)和外壳蛋白CP(5 763—6 248 nt)。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物(GenBank登录号:KY753928)同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。

关键词：葫芦黄瓜绿斑驳花叶病毒分子特征侵染性克隆致病性

广东省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

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植物保护 2019年第4期45卷 143-148页

作者：汤亚飞佘小漫李正刚于琳蓝国兵邓铭光何自福广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害,番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法,获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组... 详细信息

番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害,番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法,获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组;它们均为2 781 nt,编码6个ORF,其中病毒链上编码AV1和AV2,互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比较结果表明,4个广东分离物基因组序列两两间同源性为99%以上;与已报道的TYLCV各分离物同源性在90%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在98%以上。系统进化分析显示,广东分离物与来自中国不同地区的TYLCV分离物亲缘关系较近,并聚类在一个分支。因此,侵染引起广东佛山和肇庆番茄黄化曲叶病的病毒应来自国内其他地区。本研究是对TYLCV广东分离物分子特征的首次报道。

关键词：番茄黄化曲叶病毒分子鉴定序列分析

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番茄斑驳花叶病毒在广东省的首次报道

植物保护 2023年第3期49卷 219-225页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵李战彪何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所广西作物病虫害生物学重点实验室南宁530007

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus, ToMMV)是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种,目前在多国(地区)有发生。本文采用小RNA深度测序及RT-PCR检测方法在广东省广州市南沙区辣椒疑似病样中检测到ToMMV,命名为番茄斑驳花叶病... 详细信息

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus, ToMMV)是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种,目前在多国(地区)有发生。本文采用小RNA深度测序及RT-PCR检测方法在广东省广州市南沙区辣椒疑似病样中检测到ToMMV,命名为番茄斑驳花叶病毒广东分离物(ToMMV-GD-2020)。采用RT-PCR分段扩增获得了ToMMV-GD-2020的基因组全序列,该分离物基因组全长6 399 nt,包含4个开放阅读框,分别编码4个蛋白。序列相似性分析表明,ToMMV-GD-2020与已登录GenBank的14个ToMMV分离物基因组序列相似性分别为99.0%~99.7%,其中与中国辽宁分离物ToMMV-LN(GenBank登录号:MN853592)的相似性最高(99.7%),与危害我国番茄、同属烟草花叶病毒属的番茄花叶病毒(tomato mosaic virus, ToMV)、番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)代表分离物的相似性分别为84.6%和81.0%。系统进化分析表明,ToMMV-GD-2020与该病毒各分离物亲缘关系均较近,与中国辽宁分离物亲缘关系最近。利用ToMMV的PCR特异引物对广东其他6个市采集的67份辣椒疑似病毒病样品进行检测,结果均为阴性,这说明ToMMV目前还是局部危害广东省辣椒。本文是首次报道在广东发现ToMMV,对监测ToMMV在我国的扩散具有重要意义。

关键词：番茄斑驳花叶病毒辣椒分子鉴定病毒基因组序列

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番茄黄化曲叶病毒在湖北首次报道

植物保护 2015年第5期41卷 233-236页

作者：汤亚飞何自福杜振国佘小漫蓝国兵罗方芳广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

2014年春季,在湖北省武汉市发现种植的番茄表现植株矮缩,叶片上卷,叶缘黄化等症状。PCR检测结果显示,所有采集的病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。进一步通过滚环扩增方法获得了该病毒的湖北分离物HB01的全基因组。基因克隆及序列... 详细信息

2014年春季,在湖北省武汉市发现种植的番茄表现植株矮缩,叶片上卷,叶缘黄化等症状。PCR检测结果显示,所有采集的病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。进一步通过滚环扩增方法获得了该病毒的湖北分离物HB01的全基因组。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒基因组全长为2 781nt,与已报道的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)各分离物同源性在89.0%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在97.0%以上。因此,HB01属于TYLCV的一个分离物。

关键词：番茄黄化曲叶病毒基因克隆序列分析

戊唑醇和咯菌腈复配对火龙果褐腐病菌的联合毒力及田间防效

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广东农业科学 2020年第5期47卷 74-79页

作者：蓝国兵何自福于琳汤亚飞李正刚邓铭光佘小漫广东省农业科学院植物保护研究所广东广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640

【目的】明确戊唑醇和咯菌腈复配对火龙果褐腐病菌联合毒力与田间防治效果。【方法】采用生长速率法测定戊唑醇、咯菌腈及其复配药剂对火龙果褐腐病菌的室内毒力,以Wadley法评价增效作用,并验证了复配药剂对火龙果褐腐病的田间防效。【... 详细信息

【目的】明确戊唑醇和咯菌腈复配对火龙果褐腐病菌联合毒力与田间防治效果。【方法】采用生长速率法测定戊唑醇、咯菌腈及其复配药剂对火龙果褐腐病菌的室内毒力,以Wadley法评价增效作用,并验证了复配药剂对火龙果褐腐病的田间防效。【结果】咯菌腈和戊唑醇对火龙果褐腐病菌均表现出良好的抑菌效果,EC50值分别为0.0045、0.0671 mg/L。戊唑醇与咯菌腈不同配比对火龙果褐腐病菌表现为加和作用。有效浓度分别为100 mg/kg和500 mg/kg连续喷施3次时,末次药后7 d,戊唑醇和咯菌腈质量比8∶2复配对火龙果褐腐病平均防效分别为80.31%和89.44%,戊唑醇单剂平均防效分别为80.24%和89.71%,咯菌腈单剂平均防效分别为70.08%和76.29%;末次药后15 d,戊唑醇和咯菌腈质量比8∶2复配平均防效分别为76.80%和83.63%,戊唑醇单剂平均防效分别为74.63%和81.22%,咯菌腈单剂平均防效分别为54.53%和65.24%;复配药剂两种施药浓度的防效均比使用相同浓度单一药剂的防效高。【结论】戊唑醇和咯菌腈质量比为8∶2的复配药剂对火龙果褐腐病菌具有良好的抑菌效果,在田间防治效果好且对火龙果无药害,可以在火龙果生产上推广使用。

关键词：戊唑醇咯菌腈火龙果褐腐病菌联合毒力田间防效

16种杀菌剂对火龙果褐腐病菌抑菌持效期及田间防效试验

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广东农业科学 2019年第12期46卷 95-101页

作者：蓝国兵何自福于琳汤亚飞李正刚邓铭光佘小漫广东省农业科学院植物保护研究所广东广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640

【目的】筛选对火龙果褐腐病菌(Neoscytalidium dimidiatum)抑菌持效期长且田间防治效果好的杀菌剂,为火龙果生产上最具毁灭性的褐腐病防治提供科学依据。【方法】采用琼脂扩散法,通过测量和观察抑菌圈大小及消失时间测定16种杀菌剂抑... 详细信息

【目的】筛选对火龙果褐腐病菌(Neoscytalidium dimidiatum)抑菌持效期长且田间防治效果好的杀菌剂,为火龙果生产上最具毁灭性的褐腐病防治提供科学依据。【方法】采用琼脂扩散法,通过测量和观察抑菌圈大小及消失时间测定16种杀菌剂抑制病菌生长的持效期,对其中抑菌效果好或持效期长的杀菌剂开展田间药效试验与防效比较。【结果】咯菌腈、丙环唑、丙硫菌唑、戊唑醇、氟硅唑、异菌脲等6种杀菌剂对病菌的抑菌持效期长,培养15 d后抑菌圈尚未消失;咪鲜胺、苯醚甲环唑、腈菌唑等3种杀菌剂对病菌的抑菌持效期较长;多菌灵、噻菌灵、嘧菌酯等3种杀菌剂初期对病菌的抑菌持效期较短;丙森锌、春雷霉素、百菌清、氟环唑等4种杀菌剂的抑菌持效期极短。田间药效试验显示,戊唑醇、异菌脲、氟硅唑、丙硫菌唑、丙环唑等5种杀菌剂对火龙果嫩茎具有良好的防治效果;除丙环唑在500 mg/kg施药浓度下对火龙果嫩茎生长产生抑制作用外,其余4种杀菌剂对火龙果生长安全。【结论】生产上优先推荐使用具有内吸活性的戊唑醇、异菌脲、氟硅唑、丙硫菌唑、丙环唑等药剂防治火龙果褐腐病,轮换用药;在病情压力较大的果园,施药浓度可以适当加大。

关键词：火龙果褐腐病菌杀菌剂持效期防治效果