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广东番茄巨芽病植原体的分子鉴定

植物保护 2024年第1期50卷 203-210页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵何自福广东省农业科学院植物保护研究所农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

2022年,对在广东省湛江市廉江市田间发现的疑似番茄巨芽病病株,利用分子生物学方法对其相关植原体进行了鉴定。以番茄病株叶片总DNA为模板,利用植原体16S rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增,获得了广东番茄巨芽病植原体(TBB-GD-... 详细信息

2022年,对在广东省湛江市廉江市田间发现的疑似番茄巨芽病病株,利用分子生物学方法对其相关植原体进行了鉴定。以番茄病株叶片总DNA为模板,利用植原体16S rRNA基因通用引物R16mF2/R16mR1进行PCR扩增,获得了广东番茄巨芽病植原体(TBB-GD-2022)16S rRNA基因片段(1 430 bp, GenBank登录号为ON102780)。16S rRNA基因序列相似性分析显示,TBB-GD-2022与16SrⅡ组植原体菌株的相似性较高,为96.82%~100%,其中与隶属于16SrⅡ-V亚组的6个植原体株系相似性为100%。系统进化分析显示,TBB-GD-2022与16SrⅡ组各植原体株系聚类在一个大分支,并与16SrⅡ-V亚组成员聚类在一个小分支,亲缘关系较近。16S rRNA基因相似系数分析表明,TBB-GD-2022与16SrⅡ-V亚组的参照株系‘Praxelis clematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank登录号:KY568717)的相似系数为1.00。上述研究结果表明,广东番茄巨芽病植原体隶属16SrⅡ-V亚组成员。本文首次报道在广东发现番茄巨芽病,通过其16S rRNA序列分析进一步确定了其相关植原体的分类地位,为该病害的防控提供了科学依据。

关键词：番茄巨芽病植原体 16S rRNA 分子鉴定

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侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征

园艺学报 2018年第11期45卷 2209-2216页

作者：汤亚飞裴凡于琳何自福佘小漫蓝国兵邓铭光广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物(ChiVMV-GD)的基因组全序列,结果表明,除poly... 详细信息

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物(ChiVMV-GD)的基因组全序列,结果表明,除poly(A)尾外,ChiVMV-GD基因组大小为9 721 nt,编码一个大小350.44 kD多聚蛋白(位于167～9 436 nt),5′–非编码区(5′-UTR)和3′–非编码区(3′-UTR)分别含有166和285 nt,5′–末端结合病毒基因组连接蛋白(VPg),3′–末端含有poly(A)尾。序列同源性分析结果表明:Chi VMV-GD与Chi VMV其他分离物的基因组序列同源率为79.1%～96.9%,其中与来自中国海南分离物(登录号:GQ981316.1)的同源率最高(96.9%)。系统进化分析结果显示,ChiVMV-GD与海南分离物聚集在一个小分支,说明与海南分离物亲缘关系最近。

关键词：辣椒辣椒脉斑驳病毒广东分离物分子特征

木尔坦棉花曲叶病毒RPA快速检测方法的建立

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植物保护 2022年第1期48卷 163-167,197页

作者：汤亚飞李正刚佘小漫于琳蓝国兵何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMuV)引起的病害是世界棉花生产上的毁灭性灾害,也是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,建立快速检测技术对CLCuMuV的检疫和防控具有重要意义。本研究根据CLCuMuV外壳蛋白(CP)... 详细信息

木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMuV)引起的病害是世界棉花生产上的毁灭性灾害,也是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,建立快速检测技术对CLCuMuV的检疫和防控具有重要意义。本研究根据CLCuMuV外壳蛋白(CP)基因序列设计引物,建立了该病毒的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,并评价了该方法的灵敏度和特异性,进一步测定了对田间疑似病样的检测准确性。结果表明,建立的RPA检测方法仅能从感染CLCuMuV的样品中扩增出目的条带,而感染同属的其他5种病毒的样品中未扩增出目的条带。该方法检测灵敏度是常规PCR的10倍,且对田间疑似病样的检出结果与PCR试验结果一致。因此,本研究所建立的CLCuMuV RPA快速检测方法具有特异、灵敏、准确、操作简便、无需特殊设备等优点,这些为CLCuMuV的快速检测提供了一种新技术。

关键词：木尔坦棉花曲叶病毒 RPA 快速检测

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芜菁花叶病毒广东分离物的分子特征和序列分析

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植物保护学报 2021年第4期48卷 929-930页

作者：汤亚飞张丽李正刚蓝国兵于琳何自福佘小漫广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV)是一种(+)ssRNA病毒,基因组全长约为10 kb,根据其基因组系统进化关系,可划分为basal-Brassica(basal-B)、basal-Brassica/Raphanus(basal-BR)、Asian-Brassica/Raphanus(Asian-BR)、world-Brassica(world-B)、Iranian和Orchis共6个组(Yasaka et al.,2017)。该病毒寄主范围广、危害大,至少能侵染43科156属300多种植物。目前,TuMV在我国大部分地区均有分布,已成为危害十字花科蔬菜的优势病毒。

关键词：芜菁花叶病毒寄主范围十字花科蔬菜分离物 TuMV 系统进化关系

2009—2014年间广东省菜心炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性

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农药学学报 2018年第2期20卷 249-253页

作者：蓝国兵于琳何自福佘小漫汤亚飞邓铭光广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

为了解广东省菜心炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性差异和变化,于2009—2014年从广东省15个县/市菜心产区分离获得105个菜心炭疽病菌菌株,采用菌丝生长速率法测定了其对咪鲜胺的EC50值,并比较了同一年份不同地区菜心炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏... 详细信息

为了解广东省菜心炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性差异和变化,于2009—2014年从广东省15个县/市菜心产区分离获得105个菜心炭疽病菌菌株,采用菌丝生长速率法测定了其对咪鲜胺的EC50值,并比较了同一年份不同地区菜心炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性差异和不同年份间菜心炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性变化。结果显示：同一年份菌株间,采自2009年间的菌株对咪鲜胺的敏感性差异最小,敏感性最低地区菌株的平均EC（50）值是最高地区菌株的1.2倍;采自2014年间的菌株对咪鲜胺的敏感性差异最大,敏感性最低地区菌株的平均EC50值是最高地区菌株的34.9倍;其余年份间的不同地区最大平均EC（50）值和最小平均EC50值相差9.2~10.4倍。不同年份菌株间,2010年的菌株对咪鲜胺的敏感性最高,平均EC（50）值为0.052 0μg/m L;2012年的菌株对咪鲜胺的敏感性最低,平均EC（50）值为0.259 9μg/m L;2012—2014年的菌株对咪鲜胺的平均EC（50）值范围在0.104 5~0.259 9μg/m L之间,高于2009—2011年的菌株对咪鲜胺的平均EC（50）值（0.052 0~0.074 3μg/m L）。2009—2014年广东省田间菜心炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性呈降低趋势,存在潜在抗药性风险。

关键词：菜心炭疽病菌咪鲜胺敏感性

假茄科雷尔氏菌引起向日葵青枯病在中国的首次报道

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植物保护 2023年第2期49卷 243-249页

作者：佘小漫李萍蓝国兵于琳李正刚汤亚飞何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病,并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明,引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科... 详细信息

茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病,并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明,引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum。生理生化特性和致病性鉴定结果表明,分离自向日葵的15株假茄科雷尔氏菌为1号生理小种和生化变种3。egl基因部分序列系统进化分析表明,15株假茄科雷尔氏菌分属4个序列变种,其中8株菌株为序列变种17,5株菌株为序列变种13,其余2株菌株分别为序列变种14和序列变种54。本文是我国首次报道假茄科雷尔氏菌侵染引起向日葵青枯病。

关键词：向日葵假茄科雷尔氏菌致病性分子鉴定序列变种

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霸王花褐腐病的病原鉴定

华南农业大学学报 2014年第1期35卷 60-63页

作者：蓝国兵何自福罗方芳汤亚飞佘小漫杜振国广东省农业科学院植物保护研究所广东广州510640 广东省植物保护新技术重点实验室广东广州510640

【目的】明确导致广东省霸王花Hylocereusundatus褐腐病的病原种类．【方法】通过病组织分离、致病性测定、形态学观察及rDNA序列分析等方法对广东省霸王花褐腐病病原进行了种类鉴定．【结果和结论】在PDA培养基上，病原菌的菌落为深灰... 详细信息

【目的】明确导致广东省霸王花Hylocereusundatus褐腐病的病原种类．【方法】通过病组织分离、致病性测定、形态学观察及rDNA序列分析等方法对广东省霸王花褐腐病病原进行了种类鉴定．【结果和结论】在PDA培养基上，病原菌的菌落为深灰色，绒毛状．产生2种类型的节孢子：一种为浅色、薄壁的柱状孢子，大小为（5．00—10．69）μm×（2．61～4．52）μm；另一种为褐色、厚壁、圆形或椭圆形、基部平截、成链的孢子，大小为（5．15～12．39）μm×（3．87～6．07）um．应用真菌通用引物ITSI和ITS4进行PCR，获得该病原菌579bp的18S-28SrDNAITS序列．BLAST结果显示，该序列与Neoscytalidiumdimidiatum火龙果菌株的18S-28SrDNAITS序列相似性最高，为99％-100％．这些研究结果表明，引起广东省霸王花褐腐病的病原菌为***．

关键词：霸王花褐腐病病原鉴定

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广东花生丛枝病植原体的分子鉴定

植物保护 2022年第5期48卷 83-90页

作者：汤亚飞林祺佘小漫李正刚于琳蓝国兵何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640 华南农业大学植物保护学院广州510642

2020年在广东省湛江市遂溪县田间发现表现明显丛枝、小叶,类似植原体感染症状的花生病株。本研究利用分子生物学技术对其病原进行鉴定。以花生病叶的总DNA为模板,利用植原体16S rRNA和SecY基因通用引物进行PCR扩增,获得广东花生丛枝病... 详细信息

2020年在广东省湛江市遂溪县田间发现表现明显丛枝、小叶,类似植原体感染症状的花生病株。本研究利用分子生物学技术对其病原进行鉴定。以花生病叶的总DNA为模板,利用植原体16S rRNA和SecY基因通用引物进行PCR扩增,获得广东花生丛枝病植原体(PnWB-GDSX-2020)16S rRNA基因片段(1 430 bp,GenBank登录号为MZ427281)和SecY基因片段(1 709 bp,GenBank登录号为MZ437794)。序列一致性和系统进化分析显示,PnWB-GDSX-2020的16S rRNA序列与16SrⅡ-A、16SrⅡ-D和16SrⅡ-V亚组植原体一致性最高,亲缘关系最近;进一步利用iPhyClassifier对16S rRNA序列进行在线虚拟RFLP分析,结果显示,PnWB-GDSX-2020的虚拟RFLP图谱与16SrⅡ-V亚组的参照株系‘Praxelis clematidea’ phyllody phytoplasma (GenBank登录号:KY568717)酶切图谱一致,相似系数为1.00。因此,PnWB-GDSX-2020属于16SrⅡ-V亚组成员。所获得的PnWB-GDSX-2020 Sec Y基因序列与花生丛枝植原体的一致性最高,亲缘关系最近。本文确定了广东花生丛枝病相关植原体的分类地位,为当地病害诊断、检测以及防控提供科学依据。

关键词：花生丛枝病植原体分子鉴定 16S rRNA SecY基因序列分析

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广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

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中国农业科学 2023年第23期56卷 4684-4695页

作者：苏琦汤亚飞佘小漫蓝国兵于琳吴正伟李正刚何自福广东海洋大学滨海农业学院广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和... 详细信息

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类，建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法，提高蒲瓜病毒种类鉴定效率，为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间，从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份，对采集的样品按照地区和症状进行分类，提取每份样品的总RNA，将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果，设计特异引物进行RT-PCR验证，从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒，根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物，通过优化反应体系和反应条件，建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中，共检测到12种病毒，按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒（Lagenaria siceraria alphaendornavirus,LSEV）(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒（zucchini tigre mosaic virus,ZTMV）(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒（watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV）(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒（cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV）(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus,SLCCNV）(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒（cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV）(3.8%)、甜瓜黄斑病毒（melon yellow spot virus,MYSV）(1.3%)。78份样品中，复合侵染率高达80.8%，其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物，12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物，引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL，从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种，其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒；复合侵染现象较普遍，以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高；研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术，提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。

关键词：蒲瓜病毒病小RNA深度测序 RT-PCR检测多重PCR方法