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H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

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中国畜牧兽医 2020年第9期47卷 2945-2952页

作者：程艺田辉张亚薛景景盛东北刘武杰王婉冰张盼涛田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471000

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒(AIV),命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量(EID50)为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间(MDT)为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特... 详细信息

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒(AIV),命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量(EID50)为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间(MDT)为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.***.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定遗传进化免疫原性

不同质粒载体对GFP单基因瞬时转染ExpiCHO-S细胞表达量的影响

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福建农业学报 2020年第8期35卷 851-856页

作者：王妍张超林王娟邓跃苏晓蕊谭菲菲田克恭河南农业大学牧医工程学院河南郑州450046 国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471003

【目的】ExpiCHO细胞瞬时表达能够快速有效地生产重组蛋白,为筛选有效的重组蛋白节省了大量的时间,细胞系的选择、表达载体的选择、转染试剂的选择等是制约ExpiCHO细胞瞬时表达蛋白的重要因素,本研究旨在筛选出在CHO细胞中瞬时表达量较... 详细信息

【目的】ExpiCHO细胞瞬时表达能够快速有效地生产重组蛋白,为筛选有效的重组蛋白节省了大量的时间,细胞系的选择、表达载体的选择、转染试剂的选择等是制约ExpiCHO细胞瞬时表达蛋白的重要因素,本研究旨在筛选出在CHO细胞中瞬时表达量较高的载体。【方法】以GFP基因作为目的基因,用不同的真核表达载体构建GFP重组质粒,瞬时转染ExpiCHO-S细胞。转染后4 d观察不同载体表达GFP的荧光数量和强度;转染后8 d对细胞进行裂解,收获裂解上清,用SDS-PAGE对不同载体的表达量进行鉴定。同时用His Trap FF亲和层析柱对裂解上清中的GFP蛋白进行纯化,通过Western Blot比较不同载体GFP蛋白的表达量。【结果】pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP载体表达的荧光数量最多,pCIneo-GFP载体表达的荧光强度最强,pCMVHA载体表达的荧光数量最少,荧光强度最弱。SDS-PAGE和Western Blot结果均表明pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP、pCIneo-GFP重组质粒的蛋白表达量高于pCHO-GFP、pCMVHA-GFP重组质粒的蛋白表达量。【结论】筛选出表达量较高的真核表达载体pCDNA3.1、pCDNA3.4、pCIneo,为后续重组蛋白的瞬时表达载体选择提供依据。

关键词： GFP CHO细胞真核表达载体

基于重组技术的低毒力高效大肠杆菌原核表达系统的改造与应用

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微生物学通报 2021年第2期48卷 686-696页

作者：黄玉欣李鹏昊王孟月吴芃刘鹏逄文强田克恭国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000

[背景]大肠杆菌作为原核表达系统常用宿主菌株,具有培养成本低、周期短和操作性强等优势,但同时也存在着一些不足。[目的]降低大肠杆菌内毒素合成水平及毒力,同时提高其可溶性表达外源蛋白的能力。[方法]利用CRISPR-Cas技术敲除大肠杆菌... 详细信息

[背景]大肠杆菌作为原核表达系统常用宿主菌株,具有培养成本低、周期短和操作性强等优势,但同时也存在着一些不足。[目的]降低大肠杆菌内毒素合成水平及毒力,同时提高其可溶性表达外源蛋白的能力。[方法]利用CRISPR-Cas技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)脂多糖生物合成途径中的lpxM,改变其毒性中心类脂A的侧链结构;在基因组中整合表达tig提供蛋白折叠所需伴侣因子;构建pET-28a-Rcodon重组载体,补充蛋白表达所需稀有密码子对应的tRNAo[结果]lpxM缺失后菌体细胞内毒素合成水平较出发菌株降低90%左右;利用改造后的重组菌株和载体,可显著提高鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的可溶性表达水平;临床安全性试验结果表明,重组菌株BL21(DE3)ΔlpxM::tig合成内毒素的毒力水平较出发菌株显著降低,表达抗原对应免疫组个体无任何临床免疫副反应出现。[结论]利用重组技术对大肠杆菌原核表达系统进行改造,并用于外源蛋白的低毒力高效可溶性表达,为相关亚单位疫苗的研究奠定了一定的基础。

关键词：大肠杆菌脂多糖内毒素可溶性表达临床安全性

Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效果比较

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中国动物传染病学报 2023年第3期31卷 67-73页

作者：杜东颖霍环艳田辉王璐璐王孟月洪素梅高晓静田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471000

为了比较不同抗原含量的Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效力差异,本研究制备不同抗原含量的亚单位疫苗和全病毒灭活疫苗,采用超低免疫剂量20μL/只免疫SPF鸡,免疫21 d后攻毒,通过死亡率、临床症状、大... 详细信息

为了比较不同抗原含量的Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效力差异,本研究制备不同抗原含量的亚单位疫苗和全病毒灭活疫苗,采用超低免疫剂量20μL/只免疫SPF鸡,免疫21 d后攻毒,通过死亡率、临床症状、大体剖检病变、免疫组化和泄殖腔拭子排毒等进行免疫效力比较。试验结果表明,亚单位疫苗抗原含量AGP效价不低于1∶8,全病毒灭活疫苗抗原含量为10^(7.0)TCID_(50)/0.1 mL时,可抵抗Ⅰ群禽腺病毒(4型)强毒株的攻击,提供100%的免疫攻毒保护,攻毒后3、5、7 d泄殖腔拭子均未见排毒,且免疫组化均为阴性。亚单位疫苗抗原含量AGP效价为1∶4,全病毒灭活疫苗抗原含量为106.5 TCID_(50)/0.1 mL时,在超低免疫剂量情况下,仍可提供至少80%的免疫攻毒保护,且攻毒后3、5、7 d泄殖腔拭子排毒率仅为2/10~3/10,免疫组化阳性率仅为1/10。但全病毒灭活疫苗抗原含量为106.0 TCID_(50)/0.1 mL时,免疫攻毒保护效果不理想。综合以上结果表明,Fiber-2蛋白具有良好的免疫原性,抗原含量AGP效价不低于1∶4,与全病毒灭活疫苗抗原含量为106.5 TCID_(50)/0.1 mL免疫效力相当,可用于疫苗研制开发。

关键词：禽腺病毒 Fiber-2蛋白亚单位疫苗全病毒灭活疫苗免疫攻毒保护

猪细小病毒BJ2株的分离鉴定及全基因组序列分析

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河南农业科学 2023年第2期52卷 136-144页

作者：赵文影张云静白小飞孙玉洁郭玲花黄柏成田克恭国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000 普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳471000

为了解国内猪细小病毒(PPV)的流行、毒株变异情况,采用PPV特异性PCR方法检测2020—2021年从江苏、河南和北京3个省市采集的组织样品,将PPV阳性病料接种猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离,利用间接免疫荧光方法(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)和... 详细信息

为了解国内猪细小病毒(PPV)的流行、毒株变异情况,采用PPV特异性PCR方法检测2020—2021年从江苏、河南和北京3个省市采集的组织样品,将PPV阳性病料接种猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离,利用间接免疫荧光方法(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)和电镜观察对分离株进行鉴定,并测定分离株全基因组核苷酸序列,之后应用MEGA 6.0和MegAlign软件对分离株进行遗传变异分析。结果表明,成功分离到1株PPV,命名为BJ2株;全基因组核苷酸一致性分析结果显示,BJ2株与皮炎型强毒株Kresse株、Challenge株核苷酸一致性为99.3%,与实验室2019年分离株HeN1202株核苷酸一致性为95.9%;VP2基因核苷酸一致性和遗传进化分析结果显示,BJ2株与德国27a株处于同一进化分支,其核苷酸一致性为99.3%,HeN1202株与弱毒株NADL-2株亲缘关系较近;BJ2株与德国27a株相比,VP2蛋白氨基酸序列存在2个位点差异。综上,PPV BJ2株与德国27a株亲缘关系较近。

关键词：猪细小病毒分离鉴定 VP2基因序列分析抗原漂移

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新城疫基因Ⅶ型多联灭活疫苗的研究

中国动物传染病学报 2022年第5期30卷 183-188页

作者：洪素梅田辉张盼涛王婉冰薛景景杜东颖胡小飞刘武杰田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471000 普莱柯生物工程股份有限公司洛阳471000

本研究旨在研制鸡新城疫(NDV)基因Ⅶ型多联灭活疫苗。利用基因Ⅶ型N7a株病毒液浓缩适当倍数后灭活制备抗原,与浓缩的鸡传染性支气管炎(IB)等抗原等比混合,制备新流二联、新支流三联和新支流法四联苗,免疫SPF鸡评价其近期免疫效力和免疫... 详细信息

本研究旨在研制鸡新城疫(NDV)基因Ⅶ型多联灭活疫苗。利用基因Ⅶ型N7a株病毒液浓缩适当倍数后灭活制备抗原,与浓缩的鸡传染性支气管炎(IB)等抗原等比混合,制备新流二联、新支流三联和新支流法四联苗,免疫SPF鸡评价其近期免疫效力和免疫持续期。结果显示:用浓缩N7a抗原制备的联苗ND HI为8.1~8.4log2,高于未浓缩N7a抗原制备的新支流法四联苗(ND HI为7.4log2);浓缩与未浓缩N7a抗原制备的四联苗IB、AI和IBD抗体无明显差异,浓缩N7a抗原制备的新支流法四联苗免后6个月各组分抗体水平依然达到保护标准。综上,基因Ⅶ型NDV N7a株可用于制备新流二联苗、新支流三联苗和新支流法四联苗,不同组分之间抗原相容性好,且新支流法四联苗的免疫持续期可达6个月。

关键词：鸡新城疫浓缩四联灭活疫苗免疫持续期

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基于单克隆抗体捕获的猪血清和乳汁中PEDVIgA抗体间接ELISA方法的建立和评估

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中国畜牧兽医 2020年第7期47卷 2248-2255页

作者：王治平张云静孙玉洁徐鑫汪志艳黄柏成田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471003

为快速准确地评价猪血清和乳汁中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体水平,本研究从4株PEDV单克隆抗体中筛选得到1株可高效捕获PEDV全病毒粒子(灭活的病毒细胞培养原液)的特异性IgG单克隆抗体8A3,将其用作... 详细信息

为快速准确地评价猪血清和乳汁中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体水平,本研究从4株PEDV单克隆抗体中筛选得到1株可高效捕获PEDV全病毒粒子(灭活的病毒细胞培养原液)的特异性IgG单克隆抗体8A3,将其用作检测孔内的包被抗体以捕获病毒粒子制备抗原板,从而建立了用于检测母猪血清和乳汁中PEDV特异性IgA抗体的间接ELISA方法。该方法中,单克隆抗体8A3的最适包被浓度为6.0μg/mL,阴性判定临界值(D450 nm)为0.34,且在检测中不与常见的猪病毒阳性血清反应。与传统的免疫过氧化物酶单层检测(immuno-peroxidase monolayer assay,IPMA)相比,所建立的ELISA方法检测阳性和阴性血清的符合率分别为98.7%(152/154)和98.0%(145/148);检测初乳和乳汁样品的阳性和阴性符合率分别为100%(60/60)和95.8%(23/24);检测初乳和泌乳期样品中的IgA水平与中和效价的趋势高度相关(kappa=0.835)。本研究建立的检测PEDV IgA的间接ELISA方法灵敏度、敏感性和特异性与传统方法高度一致,可简化检测步骤,适用于大规模评价临床样本乳汁和血清中PEDV IgA抗体的快速检测。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV) 单克隆抗体(MAb) IgA抗体间接ELISA

猪伪狂犬病病毒灭活疫苗对猪伪狂犬病病毒流行毒株和经典毒株的免疫保护效果评估

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中国畜牧兽医 2021年第4期48卷 1396-1404页

作者：王玉宙谢莉敏郭玲花白小飞孙哲黄柏成肖燕田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471003

为评估猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)免疫后对PRV流行毒株和经典毒株的保护效果,本研究对试验猪分别免疫PRV灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)和PRV活疫苗(Bartha-K61),免疫后第0、7、10、14、17、21、24和28... 详细信息

为评估猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)免疫后对PRV流行毒株和经典毒株的保护效果,本研究对试验猪分别免疫PRV灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)和PRV活疫苗(Bartha-K61),免疫后第0、7、10、14、17、21、24和28天采血测定PRV gB抗体,并分别使用PRV流行毒株HN1201株和经典毒株闽A株测定免疫后第0、7、14、21和28天血清的中和抗体水平,于免疫后第28天分别使用HN1201株和闽A株攻毒并观察,之后测定体温,测定攻毒后第7和14天PRV gE抗体,及攻毒后0~8 d的排毒情况。结果显示,HN1201-ΔgE免疫组较Bartha-K61免疫组gB抗体和中和抗体产生早,且抗体水平较高。两个免疫组试验猪在攻毒后虽然均无明显临床症状,且免疫组织化学检测(IHC)组织中的病毒抗原均为阴性,但HN1201-ΔgE免疫组试验猪脏器未见任何病理损伤,Bartha-K61免疫组试验猪部分脏器具有病理损伤。与未免疫对照组相比,2个免疫组试验猪在HN1201株和闽A株攻毒后,gE抗体转阳时间晚且排毒率低,HN1201-ΔgE免疫组gE抗体水平整体均低于Bartha-K61免疫组,攻毒后排毒检测中,Bartha-K61免疫组于2个毒株攻毒后第3~5天可检测到排毒,而HN1201-ΔgE免疫组全程未检测到排毒。研究结果表明,灭活疫苗(HN1201-ΔgE株)对PRV流行毒株和经典毒株均可提供完全保护。

关键词：猪伪狂犬病灭活疫苗流行毒株经典毒株免疫保护

表达PEDV S蛋白重组PRV的构建与生物学特性评价

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 657-663页

作者：侯晓璇穆永王同燕颜世君王孟月谭菲菲田克恭河南农业大学动物医学学院河南郑州450046 国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000 普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳471000

将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株的S胞外区基因克隆至含有gG基因上、下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒pUC-ABK中,构建供体质粒pUC-ABK-S,获得线性同源重组片段AS-K-B。利用Red同源重组技术将线... 详细信息

将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株的S胞外区基因克隆至含有gG基因上、下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒pUC-ABK中,构建供体质粒pUC-ABK-S,获得线性同源重组片段AS-K-B。利用Red同源重组技术将线性同源重组片段电转化至含有pPRVBac-GFPTK-gE-gI-11k-28k-的感受态中获得重组pPRVBac-S,最后拯救获得重组病毒rPRV-S。PCR及IFA鉴定结果显示,S胞外区基因成功转录且表达,生物学特性评价结果表明重组病毒能够稳定遗传,为研制猪流行性腹泻病毒活载体疫苗提供了思路。

关键词： PEDV S蛋白 Red同源重组重组PRV