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内质网应激通路需肌醇酶1α/X盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用

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上海交通大学学报（医学版） 2019年第1期39卷 21-27页

作者：李琪周向东曾曼 Victor P.KOLOSOV juliy m.perelman 海南医学院第一附属医院呼吸内科海口570102 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心布拉戈维申斯克675000

目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,mUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予活性氧(rea... 详细信息

目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,mUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)预处理,或分别转染需肌醇酶1α(inositol-requiring kinase 1α,IRE-1α)小干扰RNA(siRNA)、X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1,XBP-1)siRNA,再予以NE刺激;同时设单纯NE组和空白对照组。试剂盒检测ROS的生成水平;Westernblotting检测干预后ERS相关信号分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,pPERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、磷酸化IRE-1α(pIRE-1α)及XBP-1蛋白表达量的变化;实时荧光定量PCR检测剪切的XBP-1(XBP-1s)mRNA水平;ELISA和免疫荧光检测mUC5AC在各组细胞中的蛋白表达情况。结果·与空白对照组相比,NE刺激24 h后细胞ROS含量增加,GRP78、ATF6、pPERK及pIRE-1α蛋白水平均显著升高(均PmRNA及蛋白表达也明显增加(均PmUC5AC蛋白表达增加(均PmUC5AC蛋白水平降低(均PmUC5AC蛋白表达也较单纯NE组明显降低,同时XBP-1s mRNA及蛋白表达也有明显下降(均PmUC5AC蛋白表达及分泌增加,ERS通路IRE-1α/XBP-1在其中发挥着一定的作用。

关键词：内质网应激需肌醇酶1α X盒结合蛋白1 中性粒细胞弹力蛋白酶活性氧黏蛋白5AC

瞬时受体电位m8离子通道对冷刺激诱导气道上皮细胞炎症反应的影响

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中华结核和呼吸杂志 2011年第10期34卷 757-761页

作者：李敏超 juliy m. perelman Victor P. Kolosov 周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心

目的探讨瞬时受体电位m8离子通道（TRPm8）在冷刺激诱导气道上皮细胞产生炎性因子过程中发挥的作用及相关信号转导机制。方法用冷空气（18℃）刺激人气道上皮16HBE细胞，以TRPm8通道特异性拮抗剂BCTC、TRPm8shRNA及蛋白激酶C（PKC）特... 详细信息

目的探讨瞬时受体电位m8离子通道（TRPm8）在冷刺激诱导气道上皮细胞产生炎性因子过程中发挥的作用及相关信号转导机制。方法用冷空气（18℃）刺激人气道上皮16HBE细胞，以TRPm8通道特异性拮抗剂BCTC、TRPm8shRNA及蛋白激酶C（PKC）特异性抑制剂钙磷酸蛋白C为干预手段，将细胞分为对照组（37℃培养）、冷刺激组、冷刺激＋BCTC组、冷刺激＋转染TRPm8 shRNA组、冷刺激＋转染对照shRNA组、冷刺激＋钙磷酸蛋白C组。Western blot法检测TRPm8 shRNA转染对16HBE细胞合成TRPm8蛋白的干扰效率；钙离子成像技术测量前5组细胞内每10s间隔的相对Ca^2＋浓度动态变化；ELISA法检测各组细胞分泌的白细胞介素（IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子（TNF）-α蛋白含量；实时荧光定量PCR检测各组细胞中IL-6、IL．8、TNF-α mRNA表达水平。结果冷刺激组细胞内相对Ca^2＋浓度最高值为2．36±0．24，显著高于对照组的1．01±0．02（t=12．52，P〈0．01），冷刺激＋BCTC组、冷刺激＋转染TRPm8 shRNA组细胞内相对Ca^2＋浓度降为1．47±0．17和1．26±0．12，显著低于冷刺激组（t值分别为6．69、9．12，均P〈0．01）；冷刺激组的IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA和蛋白含量分别为0．66±0．16、0．77±0．15、0．73±0．09、（92±13）ng／L、（125±22）ng／L、（88±12）ng／L，较对照组[0．37±0．08、0．32±0．07、0．48±0．10、（52±8）ng／L、（50±9）ng／L、（61±8）ng/L]显著升高（t值分别为3．20、5．36、3．36、5．24、6．26、3．74，均P〈0．05），冷刺激＋BCTC组[分别为0．42±0．09、0．52±0．13、0．52±0．12、（72±8）ng／L、（92±14）ng／L、（68±11）ng／L]、冷刺激＋转染TRPm8 shRNA组[分别为0．41±0．10、0．49±0．08、0．50±0．08、（60±12）ng／L、（89±14）ng／L、（68±11）ng/L]、冷刺激＋钙磷酸蛋白C组[分别为0．40±0．07、0．44±0．09、0．47±0．08、（69±9）ng／L、（86±15）ng／L、（61±10）ng／L]较冷刺激组显著降低（均P〈0．05）；冷刺激＋转染对照shRNA组[分别为0．61±0．10、0．69±0．11、0．64±0．13、（89±13）ng/L、（118±20）ng／L、（79±13）ng／L]与冷刺激组比较差异无统计学意义（t值分别为0．48、0．79、1．12、0．35、0．43、1．00，均P〉0．05）。结论冷空气可通过激活气道上皮细胞上的TRPm8离子通道而诱导Ca^2＋内流进而激活下游PKC信号通路，进而导致代表性炎性因子的表达及生成增多。

关键词：瞬时受体电位通道蛋白激酶C 白细胞介素6 白细胞介素8 肿瘤坏死因子-α

内生多肽Elafin对气道黏蛋白5AC表达的影响

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中华结核和呼吸杂志 2010年第11期33卷 801-805页

作者：余红梅李琪 juliy m.perelman Victor P.Kolosov 周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心

目的探讨内生多肽Elafin调节气道黏液高分泌的分子机制.方法构建人 Elafin 重组质粒,原代培养正常人支气管上皮细胞 HBE16,分为对照组、香烟抽提物（CSE）刺激组、CSE 刺激＋转染重组质粒、CSE 刺激＋空质粒组、单纯转染重组质粒以及... 详细信息

目的探讨内生多肽Elafin调节气道黏液高分泌的分子机制.方法构建人 Elafin 重组质粒,原代培养正常人支气管上皮细胞 HBE16,分为对照组、香烟抽提物（CSE）刺激组、CSE 刺激＋转染重组质粒、CSE 刺激＋空质粒组、单纯转染重组质粒以及空质粒组6组.四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞活力,Western blot法检测p-JNK、p-ERK、p-P38和IκBα蛋白含量,荧光素酶报告基因系统测定激活蛋白-1（AP-1）及核转录因子-κB（NF-κB）活性,RT-PCR检测各组黏蛋白（mUC）5AC mRNA 表达水平,ELISA 法分析各组细胞 mUC5AC 蛋白的相对含量.结果 CSE刺激组的p-JNK、p-ERK、p-c-Jun、IκBα、AP-1、NF-κB、mUC5AC和mUC5AC mRNA 含量分别为（0.55±0.03）μg/mg、（0.64±0.06）μg/mg、（0.60±0.07）μg/mg、（0.27±0.03）μg/mg、7.49±0.31、4.42±0.22、（0.71±0.04）mg/L和0.81±0.04,与对照组的（0.26±0.02）μg/mg、（0.30±0.05）μg/mg、（0.19±0.04）μg/mg（0.61±0.04）μg/mg、2.54±0.22、2.37±0.16、（0.23±0.02）mg/L和0.32±0.03比较差异有统计学意义（均P＜0.05）.转染重组Elafin后再给予CSE刺激,p-JNK、p-ERK、p-c-Jun、IκBα、AP-1、NF-κB、mUC5AC和mUC5AC mRNA含量分别为（0.38±0.04）μg/mg、（0.31±0.04）μg/mg、（0.14±0.03）μg/mg、（0.54±0.03）μg/mg、2.60±0.19、2.55±0.21、（0.28±0.03）mg/L、0.35±0.05,与CSE组相比差异有统计学意义（均P＜0.05）;p-P38蛋白含量在CSE刺激及转染Elafin前后无明显变化.结论内生多肽Elafin可降低JNK和ERK磷酸化水平并抑制IκBα蛋白降解,从而降低转录激活蛋白-1和核因子-κB的活性,下调黏蛋白5AC的高表达,而p38mAPK在其中的作用并不明显.

关键词：弹性蛋白酶抑制因子黏蛋白类吸烟转录因子AP-1 NF-κB

白介素13通过FOXA2调控气道上皮细胞粘液分泌

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中国免疫学杂志 2011年第2期27卷 99-102页

作者：江德鹏 Victor P.Kolosov juliy m.perelman 周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 俄罗斯医学科学院西伯利亚分院远东国立生理学和呼吸病理学科学研究中心

目的:研究白介素13(Interleukin-13,IL-13)对气道上皮细胞粘液分泌的效应并探讨其作用机制。方法:HBE16细胞在无血清培养基中培养24小时后加入IL-13刺激24小时,ELISA检测粘蛋白(mUC)5AC的表达;Western检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(E... 详细信息

目的:研究白介素13(Interleukin-13,IL-13)对气道上皮细胞粘液分泌的效应并探讨其作用机制。方法:HBE16细胞在无血清培养基中培养24小时后加入IL-13刺激24小时,ELISA检测粘蛋白(mUC)5AC的表达;Western检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase 1/2,JNK1/2的表达;使用SP600125阻滞JNK信号通路后检测mUC5AC蛋白表达;RT-PCR检测STAT4和STAT6的表达变化;EmSA检测通路下游核蛋白FOXA2的表达。结果:IL-13刺激24小时后mUC5AC和p-JNK1/2表达升高,而p-ERK1/2表达无显著变化;使用SP600125阻断JNK通路表达后,mUC5AC表达减弱;IL-13刺激后STAT4表达无显著变化,STAT6表达显著升高,FOXA2表达显著降低。结论:IL-13通过JNK-STAT6-FOXA2通路调控粘液分泌。

关键词：白介素13 c-Jun氨基端激酶 FOXA2蛋白粘液

Bronchial inflammatory profile in interferon-gamma-mediated immune response in asthma patients during airway response to cold stimulus

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Frigid Zone medicine 2022年第4期2卷 244-250页

作者： juliy m.perelman Aleksey B.Pirogov Anna G.Prikhodko Victor P.Kolosov Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration 22 Kalinina Str.Blagoveshchensk 675000Russia

Objective:To evaluate the inflammatory pattern and the interferon(IFN)-γin the bronchial secretion of asthma patients in response to acute cold *** and methods:We enrolled 42 patients with *** assessed asthma by Asthma Control Test,the lung function by spirometry before and after the bronchodilator test,followed by collecting induced *** next day,we collected exhaled breath condensate(EBC)and conducted a 3-minute isocapnic hyperventilation with cold air(IHCA),followed by collecting spontaneously produced ***:Group 1 included 20 patients with cold airway hyperresponsiveness(CAHR),and group 2 included 22 patients without *** both groups,a high level of neutrophils in bronchial secretion was observed before and after *** response to IHCA,the number of epitheliocytes in the sputum decreased to a greater extent in patients of group *** baseline epitheliocytes and the concentration of IFN-γafter IHCA had an inverse relationship(r=-0.60;P=0.017).The baseline IFN-γin EBC before and after IHCA was lower in group *** response to cold exposure directly correlated with IFN-γlevels after IHCA(Rs=0.42;P=0.014).Conclusion:In asthma patients with CAHR,there is a relationship between the persistence of mixed inflammation and the level of IFN-γin the ***-γin response to IHCA is decreased with increased cytokine utilization during cold bronchospasm,which is accompanied by the mobilization of neutrophils and the shift in the cytokine spectrum of the respiratory tract towards the T helper cells(Th)1 immune response.

关键词： asthma cold airway hyperresponsiveness mixed pattern of bronchial inflammation pro-inflammatory interferon-γ T helper cells 1 immune response

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人气道上皮细胞感知冷刺激的受体机制

第三军医大学学报 2014年第20期36卷 2071-2076页

作者：李敏超何叶 juliy m.perelman Victor P.Kolosov 周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration Siberian BranchRussian Academy of Medical SciencesBlagoveschenskRussia 675000

目的探讨温度感受器瞬时受体电位蛋白-8(transient receptor potential melastatin 8,TRPm8)在人气道上皮细胞感受冷刺激过程中发挥的作用及其机制。方法用薄荷醇及冷空气(18℃)刺激人气道上皮16HBE细胞:1以TRPm8通道特异性拮抗剂BCTC、... 详细信息

目的探讨温度感受器瞬时受体电位蛋白-8(transient receptor potential melastatin 8,TRPm8)在人气道上皮细胞感受冷刺激过程中发挥的作用及其机制。方法用薄荷醇及冷空气(18℃)刺激人气道上皮16HBE细胞:1以TRPm8通道特异性拮抗剂BCTC、TRPm8 shRNA为干预手段,动态观察在薄荷醇、冷刺激作用下细胞内Ca2+荧光强度变化来监测气道上皮细胞上TRPm8的功能;2以磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)荧光分子探针PLCδ1-PH-GFP转染细胞,通过动态观察各组细胞内PLCδ1-PH-GFP从细胞膜至细胞质的荧光转位变化来检测PIP2的动态变化来研究冷刺激作用下TRPm8的信号通路。结果 1细胞内相对钙离子浓度变化:薄荷醇组处理4 min后、冷刺激组处理6 min后分别为(5.80±0.34)、(5.02±0.36),明显高于对照组(1.04±0.12)、(1.03±0.08)(Pmmol/L薄荷醇组+BCTC组、1 mmol/L薄荷醇组+转染TRPm8 shRNA组最高值分别为(2.68±0.19)、(1.08±0.16),明显低于1 mmol/L薄荷醇组,18℃+BCTC组、18℃+转染TRPm8 shRNA组最高值分别为(1.77±0.22)、(1.02±0.18),明显低于18℃组(均Pm/Fc值):1 mmol/L薄荷醇组、冷刺激组最高值分别为(0.90±0.01)、(0.90±0.01),明显高于对照组最高值(1.01±0.02)(Pmmol/L薄荷醇+BCTC15μmol/L组、1 mmol/L薄荷醇组+转染TRPm8 shRNA组分别为(0.86±0.03)、(0.89±0.02),明显低于1 mmol/L薄荷醇组(0.36±0.06)(Pmol/L组、18℃+转染TRPm8 shRNA组分别为(0.82±0.02)、(0.93±0.01),明显低于18℃组(0.40±0.06)(Pm8受体是人气道上皮细胞感受冷刺激的主要受体,并通过TRPm8→Ca2+→PLC→PIP2信号通路引起气道黏液高分泌等反应。

关键词：气道上皮细胞冷刺激瞬时受体电位蛋白-8 Ca^2+ PIP2

Cortactin在应力诱导的气道黏液分泌过程中的介导作用

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中国免疫学杂志 2019年第11期35卷 1354-1357页

作者：吴海丰李琪 juliy m perelman Victor P Kolosov Andrei Shpakou 周向东海南医学院第一附属医院呼吸内科海口570102 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心布拉戈维申斯克675000 白俄罗斯国立杨卡·库帕拉大学运动与康复医学系格罗德诺230023

目的:探讨皮层肌动蛋白结合肽(Cortactin)对剪应力(SS)诱导的气道黏液高分泌的影响及其关键靶点。方法:体外培养气道上皮细胞Beas-2B,并随机分为6组:空白对照组、SS组、SS+Wild-Cortactin组、SS+pcDNA3-Cortactin 421 -mU组、SS+pcDNA3-... 详细信息

目的:探讨皮层肌动蛋白结合肽(Cortactin)对剪应力(SS)诱导的气道黏液高分泌的影响及其关键靶点。方法:体外培养气道上皮细胞Beas-2B,并随机分为6组:空白对照组、SS组、SS+Wild-Cortactin组、SS+pcDNA3-Cortactin 421 -mU组、SS+pcDNA3-Cortactin 466 -mU组、SS+pcDNA3-Cortactin 482 -mU组。用Western blot法检测Cortactin蛋白、p-Cortactin蛋白表达水平,RT-PCR、ELISA法分别检测mUC5AC 转录水平和mUC5AC的分泌量。结果:转染Cortactin各型重组表达载体后细胞Cortactin蛋白明显增加,提示转染成功。转染Wild-Cortactin后再予剪应力处理,细胞的p-Cortactin蛋白、mUC5AC mRNA及蛋白表达显著增加。而转染pcDNA3-Cortactin 466 -mU后,细胞p-Cortactin蛋白、细胞培养上清液mUC5AC的相对分泌量显著下降,但mUC5AC的转录水平无明显影响。结论:在剪应力刺激诱导的气道上皮细胞mUC5AC高分泌过程中,Cortactin具有重要的介导作用,且Y466为其介导该过程的潜在关键作用靶点。

关键词：皮层肌动蛋白结合肽黏蛋白5AC 气道剪应力

JNK信号转导通路在大潮气量机械通气诱发兔肺泡巨噬细胞分泌IL-8和TNF-α中的作用

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中华麻醉学杂志 2010年第10期30卷 1192-1194页

作者：童瑾 juliym.perelman VictorP.Kolosov 重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心

目的评价c-Jun氨基末端激酶（JNK）在大潮气量机械通气诱发兔肺泡巨噬细胞分泌IL-8和TNF-α中的作用.方法清洁级雄性新西兰白兔30只,体重210～260 g,随机分为3组（n=10）：正常对照组（C组）不予任何刺激;机械通气组（V组）大潮气量... 详细信息

目的评价c-Jun氨基末端激酶（JNK）在大潮气量机械通气诱发兔肺泡巨噬细胞分泌IL-8和TNF-α中的作用.方法清洁级雄性新西兰白兔30只,体重210～260 g,随机分为3组（n=10）：正常对照组（C组）不予任何刺激;机械通气组（V组）大潮气量机械通气3 d,VT 15 ml/kg,I∶E 1∶2,RR 30～40次/min,PEEP 0;SB203580干预组（S组）大潮气量机械通气3 d,同时每天机械通气时静脉注射JNK特异性抑制剂（SB203580）6 mg/kg,通气参数同V组.采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α浓度,同时收集肺泡巨噬细胞,体外培养2 h后应用RT-PCR法检测IL-8 mRNA和TNF-α mRNA水平.结果与C组比较,V组TNF-α、TNF-α mRNA、IL-8、IL-8 mRNA水平升高（P＜0.05）.与V组比较,S组TNF-α和TNF-α mRNA水平降低（P＜0.01）,IL-8和IL-8 mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 JNK信号转导通路在大潮气量机械通气诱发兔肺泡巨噬细胞分泌TNF-α过程中起重要作用,而不参与分泌IL-8的过程.

关键词： JNK丝裂原活化蛋白激酶类呼吸,人工巨噬细胞,肺泡白细胞介素8 肿瘤坏死因子α

mARCKS磷酸化对冷刺激诱导人气道上皮细胞mUC5AC分泌的影响

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中南大学学报（医学版） 2012年第5期37卷 447-452页

作者：李敏超尤列.皮尔曼周向东重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆400010 俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心

目的:构建豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物(mARCKS)磷酸化位点(PSD)突变体,并探讨瞬时受体电位m8离子通道(TRPm8)及mARCKS在冷刺激诱导黏蛋白(mUC)5AC合成及胞吐过程中发挥的作用。方法:利用PCR克隆全编码mARCKS目的基因,并通过定点突变技术... 详细信息

目的:构建豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物(mARCKS)磷酸化位点(PSD)突变体,并探讨瞬时受体电位m8离子通道(TRPm8)及mARCKS在冷刺激诱导黏蛋白(mUC)5AC合成及胞吐过程中发挥的作用。方法:利用PCR克隆全编码mARCKS目的基因,并通过定点突变技术将PSD的4个丝氨酸突变为天冬氨酸编码基因。将野生型及突变体cDNA亚克隆至pcDNA3.0载体后用酶切及DNA测序鉴定。以TRPm8特异性阻断剂BCTC、重组突变质粒转染人气道上皮16HBE细胞为干预手段,用免疫荧光及ELISA检测二者对冷空气刺激诱导的16HBE细胞合成及分泌mUC5AC的影响。结果:成功构建了pcDNA3.0-mARCKS重组质粒及pcDNA3.0-mARCKS-PSD突变体。冷刺激组胞内合成及分泌mUC5AC水平显著高于未刺激对照组(PmUC5AC合成及分泌(PmARCKS-PSD突变cDNA可显著下调由冷刺激诱导的mUC5AC高分泌水平(PmUC5AC水平与对照组比较呈现显著升高状态(PmARCKS对冷刺激诱导的mUC5AC胞内合成及胞外分泌水平无显著影响(P>0.05)。结论:TRPm8及mARCKS-PSD的磷酸化过程介导了冷刺激诱导气道上皮细胞内mUC5AC的胞吐过程。

关键词：豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物瞬时受体电位melastatin离子通道黏蛋白类