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Efficient and precise genomic deletion in rice using enhanced prime editing

aBIOTECH 2024年第2期5卷 214-218页

作者： Mengyuan Liu Xiang Zhang Wen Xu guiting Kang ya Liu Xinxiang Liu Wen Ren Jiuran Zhao jinxiao ya.g Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding Beijing Academy of Agriculture and Forestry SciencesBeijing 100097China

Efficient and precise genomic deletion shows promise for investigating the function of proteins in plant research and enhancing agricultural *** this study,we tested the PRIME-Del(PDel)strategy using a pair of prime editing guide RNAs(pegRNAs)that targeted opposite DNA strands and achieved an average deletion efficiency of 55.8%for 60 bp fragment deletions at six endogenous ***,as high as 84.2%precise deletion efficiency was obtained for a 2000 bp deletion at the OsgS1 site in transgenic rice *** add the bases that were unintentionally deleted between the two nicking sequences,we used the PDel/Syn strategy,which introduced multiple synonymous base mutations in the region that had to be patched in the RT *** PDel/Syn strategy achieved an average of 58.1%deletion efficiency at six endogenous targets,which was higher than the PDel *** strategies presented in this study contribute to achieving more accurate and flexible deletions in transgenic rice plants.

关键词： Prime editing Precise genomic deletion CRISPR Cas9

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Developing an efficient and visible prime editing system to restore tobacco 8-hydroxy-copalyl diphosphate gene for labdane diterpene Z-abienol biosynthesis

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Science China(Life Sciences) 2023年第12期66卷 2910-2921页

作者： Jianduo Zhang Lu Zhang Chengwei Zhang Yongxing ya.g Huayin Liu Lu Li Shengxue Zhang Xianggan Li Xinxiang Liu ya Liu Jin Wang guangyu ya.g Qingyou Xia Weiguang Wang jinxiao ya.g Yunnan Key Laboratory of Tobacco Yunnan Academy of Tobacco ScienceKunming 650231China Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding Beijing Academy of Agriculture&Forestry SciencesBeijing 100089China Key Laboratory of Natural Products Synthetic Biology of Ethnic Medicinal Endophytes State Ethnic Affairs CommissionYunnan Minzu UniversityKunming 650031China Cropedit Biotechnology Co.Ltd. Beijing 102206China Biological Science Research Center Southwest UniversityChongqing 400716China

Prime editing(PE)is a versatile CRISPR-Cas based precise genome-editing platform widely used to introduce a range of possible base conversions in various ***,no PE systems have been shown to induce heritable mutations in tobacco,nor in any other *** this study,we generated an efficient PE system in tobacco that not only introduced heritable mutations,but also enabled anthocyanin-based reporter selection of transgene-free T_(1) *** system was used to confer Zabienol biosynthesis in the allotetraploid tobacco cultivar HHDJY by restoring a g>T conversion in the NtCPS2 *** levels of Z-abienol were detected in the leaves of homozygous T_(1) plants at two weeks after *** study describes an advance in PE systems and expands genome-editing toolbox in tobacco,even in dicots,for use in basic research and molecular *** restoring biosynthesis of Z-abienol in tobacco might provide an efficient way to obtain Z-abienol in plants.

关键词： prime editing Z-abienol biosynthesis visible marker CRISPR Cas9 tobacco

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Discriminated sgRNAs-Based Surrogate System greatly Enhances the Screening Efficiency of Plant Base-Edited Cells

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Molecular Plant 2020年第1期13卷 169-180页

作者： Wen Xu Yongxing ya.g ya Liu guiting Kang Feipeng Wang Lu Li Xinxin Lv Si Zhao Shuang Yuan Jinling Song Ying Wu Feng Feng Xiaoqing He Chengwei Zhang Wei Song Jiuran Zhao jinxiao ya.g Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding Beijing Academy of Agriculture&Forestry SciencesBeijing 100080China

The development of CRISPR/Cas9-mediated base editing has made genomic modification more efficient. However, selection of genetically modified cells from millions of treated cells, especially plant cells, is still challenging. In this study, an efficient surrogate reporter system based on a defective hygromycin resistance gene was established in rice to enrich base-edited cells. After step-by-step optimization, the Discriminated sgRNAs-based Surrogate system (DisSUgs) was established by artificially differentiating the editing abilities of a wild-type single guide RNA (sgRNA) targeting the surrogate reporter gene and an enhanced sgRNA targeting endogenous sites. The DisSUgs enhanced the efficiency of screening base-edited cells by 3- to 5-fold for a PmCDA1-based cytosine-to-tyrosine base editor (PCBE), and 2.5- to 6.5-fold for an adenine base editor (ABE) at endogenous targets. These targets showed editing efficiencies of gs greatly enhanced the frequency of homozygous substitutions and expanded the activity window slightly for both a PCBE and an ABE. Analyses of the total number of single-nucleotide variants from whole-genome sequencing revealed that, compared with the no-enrichment PCBE strategy, the DisSUgs did not alter the frequency of genome-wide sgRNA-independent off-target mutations, but slightly increased the frequency of target-dependent off-target mutations. Collectively, the DisSUgs developed in this study greatly enhances the efficiency of screening plant base-edited cells and will be a useful system in future applications.

关键词： cell enrichment surrogate reporter cytosine base editors adenine base editors

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利用CRISPR/Cas9技术编辑BADH2-1/BADH2-2创制香米味道玉米新种质

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中国农业科学 2021年第10期54卷 2064-2075页

作者：张翔史亚兴卢柏山武莹刘亚王元东杨进孝赵久然北京市农林科学院玉米研究中心/玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2-AP)是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉... 详细信息

【目的】香味是作物的重要食味品质之一。2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2-AP)是主要香味物。BADH2是控制水稻等作物香味性状的关键基因,敲除该基因可以产生香味稻米。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在北京市农林科学院自育的玉米骨干亲本京724上敲除BADH2同源基因,以期获得有香米味道的玉米新种质材料。【方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEgA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase,PMI)抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry,gC-MS)检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果】系统进化分析发现,玉米中存在2个BADH2同源基因,分别命名为ZmBADH2-1和ZmBADH2-2。ZmBADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28株转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。

关键词：玉米自交系京724 CRISPR/Cas9 基因编辑 BADH2 香味 2-乙酰-1-吡咯啉

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电动汽车空调与电池热管理系统设计与匹配

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制冷与空调 2018年第1期18卷 67-71页

作者：刘志勇沈长海邹金校崔亚彭政瑜众泰汽车工程研究院长安大学

本文对电动汽车空调系统和电池热管理系统的基本功能进行了构想,在此基础上设计了系统的原理图并对系统的基本功能进行了分析。此外,文中对系统关键零部件的性能参数给出了选型方法,最后对整车环模试验数据和多工况下路试试验数据进行... 详细信息

本文对电动汽车空调系统和电池热管理系统的基本功能进行了构想,在此基础上设计了系统的原理图并对系统的基本功能进行了分析。此外,文中对系统关键零部件的性能参数给出了选型方法,最后对整车环模试验数据和多工况下路试试验数据进行分析。结果表明,本文所设计匹配的电动车空调及电池热管理系统能满足乘员舱的制冷及采暖需求,同时也能为电池组提供较适宜工作温度环境。

关键词：电动汽车空调系统电池热管理系统参数匹配

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